İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem
Summary
Burada, alt uygulamalar ve diğer farklılıklar iyileştirilmesi için kesin endoderm doğru kararlı farklılaştırılmış insan embriyonik kök hücrelerinin saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
embriyonik kök hücrelerin (ESCs) halinde pluripotent kök hücrelerin farklılaşması yetenekleri hücre yenileme terapisi için potansiyel bir terapötik uygulama sağlar. Terminal olarak farklılaşmış hücre türleri., Çeşitli dejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılan, akciğer, karaciğer ve pankreas dokularında karşı bu hücrelerin in vitro farklılaşma, bir birinci basamak olarak kesin endodermal hücrelerinin üretilmesini gerektirir edilebilir. Bu adım, oran-sınırlayıcı insülin üreten beta hücrelerinin hepatositlere ya da diğer endoderm türetilmiş hücre türleri terminal olgun hücre tipleri yönünde daha fazla türev içindir. endoderm soy doğru kararlıyız Hücreler çok böyle FOXA2, SOX17, HNF1B GATA aile üyeleri ve yüzey reseptörü CXCR4 olarak transkripsiyon faktörlerinin çok sayıda ifade eder. Ancak, farklılaşma protokolleri nadiren% 100 etkilidir. Burada, farklılaşma sonra CXCR4 + hücre popülasyonunun saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadırManyetik mikroboncuklarm kullanarak DE içine. Bu saflaştırma ek istenmeyen soy hücreleri ortadan kaldırır. yumuşak bir saflaştırma yöntemi, hızlı ve güvenilir olduğu ve aşağı doğru uygulamalar ve farklılaşmaları geliştirmek için kullanılabilir.
Introduction
embriyonik kök hücrelerin (ESCs) halinde pluripotent kök hücreleri, insan vücudunun hemen hemen herhangi bir hücre türü ayırt etmek yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, in vitro farklılaşma protokolleri, kardiyomiyositlerde 1, hepatositler 2, beta hücreleri 3 akciğer epitelyal 4 ya da nöronal hücrelerin 5 gibi çok sayıda yetişkin hücre türleri oluşturmak için de kullanılabilir. Bu ESCS çeşitli dejeneratif hastalıkların 3 potansiyel tedavisi için değerli bir araç sağlar.
Akciğer, karaciğer ve pankreas yetişkin dokularda doğru EKH in vitro farklılaşma kesin endoderm (DE) 6 andıran hücreleri içine bir sözde Gastrulasyon gerektirir. Bahsedilen somatik hücre tiplerinin üzerinden aşağı doğru farklılaşma önemli ölçüde daha az etkili olduğu için, optimal bir endoderm farklılaşma 7 oran-sınırlayıcı olarak kabul edilir. endoderm soy doğru kararlıyız Hücreler cha geçmesigen ekspresyon profili Karakteristik değişir. Pluripotensin ana düzenleyici genler aşağı düzenlenir gibi 9. CXCR4 Smad2 tarafından Transaktive bilinmektedir FOXA2, SOX17, HNF1B GATA aile üyeleri ve CXCR4 yüksek 6 yukarı düzenlenen bir yüzey reseptörü, 8, diğer transkripsiyon faktörleri salınımı / 3, bağlı, destekleyici bölgesi 10'da spesifik bağlanma sitelerine düğüm / TGF-β sinyalizasyon ve SOX17 aşağı doğru. Böylece raporları 6, 8, 11-13, bir dizi kullanılan çok uygun bir belirtecidir. Bu sentezleme değişiklikler ESCs ilk ilkel bir çizgi-benzeri hücre popülasyonunun özelliklerini kazanmak ve daha sonra endoderm tohumu tabaka 6 olarak tamamlama olan bir sözde-Gastrulasyon etkinliği yansıtmaktadır.
Birkaç hücre farklılaşma sürecine karşı veya diğer istenmeyen soyları 14 doğru ayırt edilebilir Ancak, farklılaşma protokolleri nadiren% 100 etkilidir. Bu hücreler, negatif ha olabilirnce ileri farklılaşma. Ayrıca, artık farklılaşmamış hücreler daha sonra transplantasyon deneyler için büyük riskler barındıran ve teratom 15-17 sebebiyet verebilir.
Erken yüzey işaretleyici CXCR4 DE 18 doğru işlenen hücrelerin saflaştırılması için de kullanılabilir, bu istenmeyen hücreleri çıkarmak için. Burada, DE farklılaşma kültürlerinden CXCR4 + hücreleri pozitif seçim için bir yöntem tarif eder. Bunun için, yüzey işaretleyici CXCR4 daha sonra da manyetik mikro boncuklar bağlanan bir antikor ile bağlıdır. FACS sıralama sırasında zorlu koşullarda farklı olarak, manyetik olarak etiketlenmiş DE-benzeri hücreler, daha sonra kolayca hafif bir saflaştırma yöntemi kullanılarak bir tezgah üstü bir biçimde saflaştırılabilir. Bu protokol, DE farklılaşma sürecine karşı hücre popülasyonlarının çıkarılması için basit bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şu anda kullanılan farklılaşma protokolleri nadiren% 100 farklılaşmış hücrelerin neden. hala ele alınması gereken nedenlerden dolayı bazı hücreler farklılaşma sürecini karşı. kullanılan farklılaşma protokolünün verimlilik ve ESC eğilimi bağlı kalan pluripotent hücrelerin belirli bir sayıda yaygın, hatta kesin endoderm içine farklılaşma sonra gözlenir hattı. Bunlar artık hücreler gibi transkriptomik, proteomik ve miRNA ifade analizi olarak aşağı farklılaşmaları veya daha fazla a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jasmin Kresse usta teknik yardım minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
References
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P.W., Wu, S.M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
- Naujok, O., Burns, C., Jones, P.M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet? Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
- Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
- Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
- Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
- D'Amour, K.A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
- Kim, P.T., Ong, C.J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55 303-319 (2012).
- Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
- Nostro, M.C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Bruin, J.E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Fu, W., Wang, S.J., Zhou, G.D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W.J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
- Hentze, H., Soong, P.L., Wang, S.T., Phillips, B.W., Putti, T.C., Dunn, N.R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
- Herberts, C.A., Kwa, M.S., Hermsen, H.P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 29 (2011).
- Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
- Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W.H., Baker, J.C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), e17536 (2011).
