Bioluminescent कैल्शियम सूचक GFP-aequorin के आधार पर विवो कार्यात्मक ब्रेन इमेजिंग दृष्टिकोण में
Summary
यहाँ हम एक bioluminescent संवाददाता का उपयोग कर दृष्टिकोण -imaging एक उपन्यास सीए 2 प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण सीए 2 को बांधता है और प्रकाश उत्तेजना के लिए दूर करने की जरूरत है, प्रकाश का उत्सर्जन करता है जो एक दूसरे से जुड़ने का निर्माण GFP-aequorin उपयोग करता है। गौरतलब है कि इस विधि गहरी मस्तिष्क संरचना और उच्च अस्थायी समाधान करने के लिए लंबे समय तक निरंतर इमेजिंग, पहुँच अनुमति देता है।
Abstract
Vivo इमेजिंग में कार्यात्मक समारोह और मस्तिष्क की कोशिकाओं और ब्याज की संरचनाओं के शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका बन गया है। हाल ही में bioluminescent संवाददाता GFP-aequorin (जीए) का उपयोग -imaging सीए 2 की एक नई विधि विकसित किया गया है। इसकी सहायक कारक coelenterazine के अलावा के साथ – – एक फोटान कलेक्टर के माध्यम से नजर रखी जा सकती है कि उज्ज्वल प्रकाश उत्सर्जक इस नई तकनीक कैल्शियम बंधन और के एक अणु सक्षम उत्पादन, GFP और aequorin जीनों के विलय पर निर्भर करता है। GFP-aequorin जीन ले जाने ट्रांसजेनिक लाइनों चूहों और ड्रोसोफिला दोनों के लिए उत्पन्न किया गया है। ड्रोसोफिला में, GFP-aequorin जीन मस्तिष्क के भीतर लक्षित अभिव्यक्ति और इमेजिंग के लिए अनुमति Gal4 / यूएएस द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली के नियंत्रण में रखा गया है। इस विधि को बाद में पता लगाने में सक्षम होना दिखाया गया है दोनों सीए आवक 2 + -transients और सीए 2 भीतरी दुकानों से -released। सबसे महत्वपूर्ण बात यह सतत रिकॉर्डिंग, मस्तिष्क के भीतर अधिक से अधिक गहराई में इमेजिंग में एक अधिक से अधिक अवधि के लिए अनुमति देता है, और (8.3 मिसे तक) उच्च अस्थायी प्रस्तावों पर रिकॉर्डिंग। यहाँ हम रिकॉर्ड और सीए मशरूम शरीर के भीतर 2 + -activity, मक्खी के मस्तिष्क में सीखने और स्मृति के लिए केंद्रीय एक संरचना का विश्लेषण करने के लिए bioluminescent इमेजिंग प्रयोग करने के लिए बुनियादी तरीका मौजूद है।
Introduction
मौलिक patterning और मस्तिष्क और उसके असतत संरचनाओं के भीतर गतिविधि का कार्य लंबे समय से तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र के भीतर गहन अध्ययन का क्षेत्र रहा है। शायद इस मुद्दे के समाधान के लिए किया जाता जल्द से जल्द सफल दृष्टिकोण से कुछ बिजली की गतिविधि में परिवर्तन का सीधा शारीरिक माप थे – करने के लिए अतिरिक्त क्षमताओं लाया है (गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में) वोल्टेज, पीएच या कैल्शियम की सांद्रता में परिवर्तन का जीना इमेजिंग अनुमति है, जो हालांकि वैकल्पिक तरीकों neuronal गतिविधि 1 का अध्ययन। इमेजिंग तकनीक इस तरह कम invasiveness और पूरे मस्तिष्क संरचना के भीतर गतिविधि पर नजर रखने के लिए क्षमता के रूप में लाभ की एक विस्तृत सरणी ले। इसके अलावा फल सहित विनयशील आनुवंशिकी के साथ पशुओं में ड्रोसोफिला, ऐसे Cameleon, GCaMPs और दूसरों के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों के विकास के लिए उड़ान भरने एक एकल न्यूरॉन्स, neuronal आबादी और पूरे मस्तिष्क की निगरानी करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति दी हैसंरचनाओं। अधिक परंपरागत फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग तरीकों (calmodulin के लिए जुड़े हुए सीएफपी और YFP) (calmodulin के लिए जुड़े हुए GFP) या झल्लाहट GCaMPs का उपयोग करते समय अच्छा स्थानिक और लौकिक संकल्प प्रदान उपयोगी तकनीकों साबित हुई है, प्रकाश उत्तेजना की अंतर्निहित प्रक्रिया अपने प्रयोगात्मक पर कुछ सीमाएं engenders अनुप्रयोगों। कारण फलस्वरूप imaged किया जा सकता है कि संरचनाओं की गहराई की सीमा जो अनिवार्यत: उत्पादित कर रहे हैं प्रकाश उत्तेजना, autofluorescence, तस्वीर विरंजन, और phototoxicity की प्रकृति, करने के लिए, रिकॉर्डिंग की अवधि के साथ ही रिकॉर्डिंग के वास्तविक समय निरंतरता। दूसरे शब्दों में, रिकॉर्डिंग अक्सर इन अवांछित दुष्प्रभावों से बचने के लिए बीच-बीच में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
क्योंकि इन चुनौतियों का, कैल्शियम इमेजिंग के अतिरिक्त वैकल्पिक तरीकों विकसित किया गया है। सबसे होनहार तरीकों में से एक कैल्शियम बाध्यकारी के बाद एक enzymatic प्रतिक्रिया के माध्यम से उत्पादित प्रकाश पर निर्भर करता है जो bioluminescent इमेजिंग है। Bioluminescenटी इमेजिंग पारंपरिक कैल्शियम इमेजिंग के रूप में ही कठिनाइयों का अनुभव नहीं है फलस्वरूप प्रकाश उत्तेजना की आवश्यकता होती है और नहीं है। bioluminescent संवाददाता Aequorin – Aequorea विक्टोरिया से अलग λ (GFP भी isolated- गया था जिसमें से एक ही जेलीफ़िश अपने तीन एफई हाथ संरचनाओं के माध्यम से कैल्शियम बांधता है और इसकी सहायक कारक coelenterazine के ऑक्सीकरण और नीले प्रकाश की रिहाई के लिए अग्रणी, एक गठनात्मक बदलाव आए = 469 एनएम) 2,3। Aequorin यह बहुत छोटी सी पृष्ठभूमि शोर पैदा करता है और intracellular कैल्शियम बफरिंग प्रणाली 4 के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है क्योंकि कैल्शियम यात्रियों की निगरानी के लिए आदर्श बनाता है, जो कैल्शियम (कश्मीर घ = 10 माइक्रोन) के लिए एक बहुत कम संबंध है। Aequorin पहले Xenopus अंडे 5 उत्पादित प्रकाश में तंत्रिका शामिल करने की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है neuronal गतिविधि के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए भी मंद है। इस चुनौती, फिलिप br एंड संबोधित करने के प्रयास में# 251; पाश्चर इंस्टीट्यूट में जाने और उनके सहयोगियों जेलीफ़िश 4 भीतर देशी राज्य नकल उतार GFP fusing और जीन aequorin एक आनुवंशिक निर्माण बनाया। इस संलयन जीन उत्पाद GFP के लिए गैर-radiatively ऊर्जा स्थानान्तरण जो coelenterazine, के ऑक्सीकरण के लिए अग्रणी एक गठनात्मक परिवर्तन होता है जो aequorin के तीन एफई हाथ संरचनाओं, के माध्यम से फिर से कैल्शियम बांधता है। बजाय aequorin से नीली बत्ती की GFP से हरे रंग का प्रकाश (λ = 509 एनएम) की विज्ञप्ति में यह ऊर्जा हस्तांतरण परिणाम है। GFP और aequorin के विलय भी अकेले 4 aequorin से 19-65 बार उज्जवल संलयन प्रोटीन का उत्पादन प्रकाश में मदद करने के लिए अधिक से अधिक प्रोटीन स्थिरता प्रदान करता है। मस्तिष्क के भीतर एक bioluminescent दृष्टिकोण का प्रयोग लगातार रिकार्डिंग की अवधि और दर्ज किया जा सकता है कि मस्तिष्क के भीतर संरचनाओं की संख्या के मामले में दोनों कैल्शियम इमेजिंग की वर्तमान प्रयोगात्मक आवेदन फैलता है। मोटे तौर पर पिछले काम के संदर्भ में यह है कि दोनों वैश्विक और अधिक से अधिक इसका मतलबमस्तिष्क के regionalized "गतिविधि" की विविधता (कैल्शियम यात्रियों की प्रॉक्सी के माध्यम से) पर नजर रखी जा सकती है। इससे भी महत्वपूर्ण गतिविधि को आसानी से मस्तिष्क में बेसल समारोह की पूरी समझ का पीछा करने के लिए उधार देता है जो एक वास्तविक समय और सतत आधार में, लंबे समय तक के लिए नजर रखी जा सकती है।
पिछले कुछ वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली के नियंत्रण में GFP-aequorin (Gal4 / यूएएस GFP-aequorin) 5,6 व्यक्त ट्रांसजेनिक मक्खियों को विकसित किया है। हम प्रत्यक्ष निकोटिनिक आवेदन 9 से acetylcholine रिसेप्टर उत्तेजना के बाद मशरूम निकायों में सीए 2 -activity नियमन ऐसी खुशबू 7.8 के रूप में प्राकृतिक उत्तेजनाओं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अध्ययन सेलुलर घटकों द्वारा उत्पादित रिकार्ड गतिविधि के लिए GFP-aequorin bioluminescence का इस्तेमाल किया है। इसके अलावा, हम भी लंबी अवधि की तरह पहले से संबोधित किया जा करने में सक्षम नहीं किया गया है कि प्रयोगात्मक सवाल, के एक नंबर का पता करने के लिए GFP-aequorin का इस्तेमाल किया हैसहज कैल्शियम यात्रियों और गहरा मस्तिष्क संरचना 10 के दृश्य की इमेजिंग। हाल ही में, हम स्तनधारी एटीपी रिसेप्टर P2X 2 11 प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में एक केशन चैनल, (पीएन) को व्यक्त करने के Gal4 / यूएएस प्रणाली का इस्तेमाल किया और (MB247-LexA मशरूम निकायों में GFP aequorin व्यक्त करने के लिए LexA सिस्टम का इस्तेमाल किया है, 13XLexAop2-IVS-G5A-बीपी) (बी फीफर, Janelia फार्म, यूएसए) के सौजन्य से एक। यह हमें इस तरह के एक गंध उत्तेजना के जवाब के रूप में अधिक प्राकृतिक परिस्थितियों, नकल उतार, बारी में मशरूम निकायों (पीएन के एक बहाव के लक्ष्य) को सक्रिय करता है जो एटीपी के आवेदन के द्वारा पीएन सक्रिय करने के लिए अनुमति दी गई है। कुल मिलाकर यह P2X 2 संयोजन तकनीक और GFP-aequorin प्रयोगात्मक संभावनाओं का विस्तार। मोटे तौर पर यह अलग उत्तेजनाओं और अव्यवस्थाएं गतिविधि के बेसल patterning को बदल सकते हैं के बारे में कैसे नए अध्ययन की शुरुआत, बेहतर मस्तिष्क में गतिविधि के पैटर्न को समझने का अवसर प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Cabrero एट अल में सूचना के रूप में यहाँ प्रस्तुत हाल ही में विकसित bioluminescent आधारित GFP-aequorin दृष्टिकोण जैसे गुर्दे ताराकार कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं के अन्य प्रकार में, के रूप में अच्छी तरह से अगर वांछित के र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
