여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.
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이 논문에서
요약
초록
생체 내 이미징 기능은 기능과 뇌 세포와 관심의 구조의 생리를 연구 할 수있는 강력한 방법이되고있다. 최근 발광 생물-GFP 리포터 쿼린 (GA)을 사용 -imaging 칼슘의 새로운 방법이 개발되었다. 그 팩터 코 엘렌 테라의 첨가 - - 광자 수집기를 통해 모니터링 할 수 밝은 발광을이 새로운 기술은 칼슘과 결합 할 수있는 분자의 제조, 및 GFP 쿼린 유전자 융합에 의존한다. GFP-쿼린 유전자를 운반하는 형질 전환 계통은 마우스 및 초파리 모두에 대해 생성되었다. 초파리, GFP-쿼린 유전자는 뇌 내에서 표적 발현 및 이미징을 허용 GAL4 / UAS 진 발현 시스템의 통제하에 놓여있다. 이 방법은 연속적으로 검출 할 수있는 것으로 나타났습니다 모두 칼슘 안쪽 2+ -transients과 칼슘은 내 상점에서 -released. 가장 중요한 점은 연속 촬영, 뇌 내에서 더 깊이에서 영상에 더 큰 기간 동안 허용하고, (8.3 밀리 초까지) 높은 시간 해상도로 기록. 여기에서 우리는 기록하고 칼슘에게 버섯 기관 내에서 2 + -activity, 플라이 뇌의 학습과 기억의 중심 구조를 분석하는 생물 발광 영상을 사용하기위한 기본적인 방법을 제시한다.
서론
기본적인 패턴과 뇌와 분리 된 구조 내에서 활동의 기능은 긴 신경 과학 분야 내에서 강렬한 연구의 영역이었다. 아마도 이러한 문제를 해결하는 데 이른 성공적인 방법 중 일부는 전기적 활성도의 변화를 직접 생리적 측정 하였다 -에 추가 기능을 가져왔다 (활동 프록시와 같은) 전압의 pH 또는 칼슘 농도의 변화의 라이브 영상을 허용하지만 다른 방법은 신경 활동 1의 연구. 이미징 기술은 감소 된 침습성 및 뇌 전체 구조물 내에 활동을 모니터하는 등의 장점을 가지고 다양한. 또한 과일을 포함하여 다루기 쉬운 유전학과 동물에 초파리, 같은 카멜레온, GCaMPs 등과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표의 개발을 비행 한 단일 신경 세포, 신경 세포의 인구 및 전체 뇌를 모니터링하는 연구를 허용 한구조. 전통적인 형광 칼슘 이미징 방법 (칼 모듈 린에 융합 CFP와 YFP) (칼 모듈 린에 융합 GFP) 또는 FRET을 GCaMPs를 사용하는 동안 좋은 공간 및 시간 해상도를 제공하는 유용한 기술을 입증 한 빛 여기의 기본 프로세스는 실험에 몇 가지 제한을 낳는다 응용 프로그램. 이에 의한 묘화 될 수 구조물의 깊이를 제한 불가피하게 생성되는 여기 광, 형광도, 광 표백제 및 광독성의 특성에, 녹화 시간뿐만 아니라 기록 실시간 연속성. 즉, 이러....
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프로토콜
샘플 1. 준비
- 솔루션의 준비 및 설정
- 표준 음식 매체에 24 ° C에서 모든 초파리 라인을 유지한다. 후면과 유리 병에 낮은 밀도를 유지하는 표준화 된 크기와 파리의 무게를 생성합니다.
- 유리 병에 10 명의 남성과 10 명의 여성을 처녀 추가, 그들이 짝짓기를하게하고 신선한 유리 병에 2 일마다 전송할. 파리 eclose 시작하면을 10 일 후, 매일 파리를 수확. 파리의 나이에 대한 정확한 기록을 유지하고 좋은 상태로 보관하십시오.
- 3 일에, 여성에서 남성을 분리하고 여성에게 유리 병 당 20 파리를 유지합니다. 4 오일 세에 파리를 기록합니다.
- 다음 농도의 링거액 조제 : 130 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 HEPES, 및 36 mM의 수크로오스를 정확하게 7.3으로 용액의 pH를 조정한다. 25 μ의 관류 솔루션을 준비; 링거액에 M 니코틴 100 밀리미터의 KCl.
- 경사에 (팁의 끝에서 약 35 °)를 면도날 모양의 팁을 사용하여 끝에서 1 ½ 센티미터 이상 초과베이스를 제거 : 1,000 μL 피펫 팁을 준비합니다.
- 표준 음식 매체에 24 ° C에서 모든 초파리 라인을 유지한다. 후면과 유리 병에 낮은 밀도를 유지하는 표준화 된 크기와 파리의 무게를 생성합니다.
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결과
쿼린에 GFP의 융합은 우리가 현미경 (그림 3A, 4A, 6A, 6E)에 형광 모드에서 GFP의 여기를 통해 이전에 생물 발광 영상에 관심이 우리 지역을 시각화 할 수 있습니다. 버섯 체를 자극하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이온 성 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 통해서이다. 아세틸 콜린이 수용체의 내인성 리간드이지만 우리는 니코틴이 버섯 몸에 더 재현 반응을 생산하는 것으로 나타났습니다. 그들은 특히 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체를 발현하고, 따라서 니코틴을 이용하여 우리가 다른 뇌에서 발현 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 방지 할 수 있기 때문 부분이다. 더욱이, 니코틴 아세틸 콜린보다 안정적이고, 따라서,보다 효율적이고 신뢰성있는 자극 제어를 허용한다. 전형적인 응답은 (그림 4 참조 꽃받침, 세포 기관 (CCB)과 중간 엽 (ML) 모두의 빠른 활성화로 시작표지 이미지). 일반적 CCB 응답 길게 지속되고 응답 순차 패널에 도시 된 .......
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토론
Cabrero 등의 알에보고 여기에 제시된 최근에 개발 된 생물 발광 기반 GFP - 쿼린 접근 방식은 신장 별 모양의 세포와 같은 세포의 다른 종류뿐만 아니라 원하는 것처럼, 다른 신경 세포에 칼슘 -activity의 생체 내 기능을 녹음 할 수 있습니다. 2013 년 5.
수정, 문제점 해결, 추가 구성 요소, 그리고 중요한 단계
초파리 축산
GFP - 쿼린 유전자 (pG5A) (4)는 3 개의 독립적 인 형질 전환 라인 (6)을 만들 pUAST 벡터에 삽입 하였다. 모든 라인들은 생물 발광 시험을하고, 모든 생체 내
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 미국 Sciences Wares의 E. Karplus에게 소중하고 유용한 도움과 조언을 해준 것에 대해 빚을 지고 있습니다. 이 기술의 개발과 개선에 기여한 E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, J. Stinnakre에게 감사드립니다. 또한 pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP 라인에 대해 미국 Ashburn, H.H.M.I.의 Janelia Farm에 근무하는 B. Pfeiffer와 G. Rubin에게도 감사드립니다. 이 작업은 샤토브리앙 펠로우십, 미국 워싱턴 주재 프랑스 대사관의 지원을 받아 A. Lark에게, 국립과학재단(IOS 1352882)의 지원을 받았으며, T. Kitamoto에게, 그리고 프랑스의 ANR(ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, FlyBrainImaging, 2011), Conseil Régional Ile-de France(NeRF 및 DIM), IFR-144, CNRS의 Physique-Chimie-Biologie Interface Program (2009)의 지원을 받았다. 그리고 CNRS에 의해, 프랑스에서 JR 마틴에게.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NaCl | 시그마-알드리치 | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | 시그마-알드리치 | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| 자당 | 시그마-알드리치 | S0389 | |
| 니코틴 | 시그마-알드리치 | N3876 | |
| ATP | 시그마-알드리치 | A2383 | 아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물 |
| 벤질-코엘렌테라진 | 프롤룸, 나노라이트 | 고양이 #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| 치과 접착제 | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| 실리콘 접착제 | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| 피펫 팁 | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µ l Univesal 피펫 팁 |
| 챔버 및 홀더 (스테이지) | 수제 | ||
| 인큐베이션 박스 | 핸드 메이드 | ||
| 펜치 (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | 마이크로 해부 펜치 |
| 곡선 펜치 | Sigma-Aldrich | F4142 | 마이크로 해부 펜치 |
| 접착제 애플리케이터 | 수제 | ||
| 나이프 | 파인 사이언스 도구 | 10316-14 | 5mm 깊이 15도; 찌르기 |
| EM-CCD 카메라 | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (-80으로 냉각° C) |
| 현미경 | Nikon | Eclipse-E800 | |
| 몰입 대물 렌즈 | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| 해부 현미경 형광 | Leica MZ Fl III | 라이카 해부 스코프 및 형광 램프 | |
| 타이트 다크 박스 | Science Wares | 맞춤 제작 Science | |
| Wares 연동 펌프 | Gilson | Minipuls 2 | |
| 튜빙 | Fisher Scientific | 은 두께에 따라 | 다릅니다 Tygon R3603, St-Gobain |
| 관류 시스템 | Warner | 64-0135 ( VC-66CS) | 관류 밸브 제어 시스템, 완전, 핀치 밸브, 6 채널 |
| 관류 조절기 | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| 측정 및 자동화 탐색기 | 과학 상품 및 내쇼날인스트루먼트 | /A | 소프트웨어 |
| http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 광자 이미저 | 과학 용품 & National Instruments | N/A | 소프트웨어 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| 광자 뷰어 | Science Wares & National Instuments | N/A | 소프트웨어 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | 소프트웨어 https://www.microsoft.com |
| 가상 더빙 | 오픈 액세스 | N/A | 소프트웨어 http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | {현재} 공개적으로 사용할 수 있는 주식 없음 |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. 파이퍼, 자넬리아 농장, 미국 애슈번. | (재고 #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | {현재} 공개적으로 사용할 수 있는 주식 없음 |
| OK107 | 블루밍턴 스톡 센터 | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
참고문헌
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci....
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