In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine
Summary
Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.
Abstract
Functionele in vivo beeldvorming is een krachtige aanpak om de functie en fysiologie van hersencellen en structuren van belang te bestuderen. Recent werd een nieuwe methode ontwikkeld Ca2 + -Imaging met de bioluminescente GFP reporter-aequorine (GA). Deze nieuwe techniek is gebaseerd op de fusie van GFP en aequorine genen produceren van een molecuul kan binden calcium en – de toevoeging van de coelenterazine cofactor – fel licht uitzenden dat kan worden bewaakt door een foton collector. Transgene lijnen die het GFP-aequorine gen werden gegenereerd voor zowel muis en Drosophila. In Drosophila is de GFP-aequorine-gen onder controle van de GAL4 / UAS binaire expressiesysteem waardoor gerichte expressie en beeldvorming in de hersenen gebracht. Deze methode is vervolgens aangetoond dat het opsporen van te zijn, zowel naar binnen Ca 2+ -transients en Ca 2+ -released van innerlijke winkels. Belangrijker het zorgt voor een grotere duur in continue opname, weergave op grotere diepte in de hersenen, en de opname op hoge temporele resoluties (tot 8,3 msec). Hier presenteren we de basis-methode voor het gebruik van bioluminescentie beeldvorming te registreren en te analyseren Ca 2+ -activity binnen de paddestoel lichamen, een structuur centraal in leren en geheugen in de vlieg hersenen.
Introduction
De fundamentele patronen en functie van activiteit in de hersenen en de discrete structuren lang een gebied van intensief onderzoek op het gebied van neurologie. Misschien enkele vroegste succesvolle benaderingen voor dit probleem waren direct fysiologische meting van de verandering in de elektrische activiteit – maar alternatieve methoden die levende beeldvorming van veranderingen in spanning, pH of calciumconcentraties (als indicatie voor activiteit) laten hebben extra mogelijkheden voor gebracht de studie van neuronale activiteit 1. Beeldvormingstechnieken voeren een breed scala van voordelen zoals verminderde invasiviteit en de mogelijkheid om te controleren activiteit in gehele hersenstructuren. Verder bij dieren met handelbare genetica, waaronder de fruitvlieg Drosophila, de ontwikkeling van genetisch gecodeerd calcium indicatoren, zoals cameleon, GCaMPs en anderen 1 hebben toegestaan onderzoekers enkele neuronen, neuronale populaties en hele hersenen te controlerenstructuren. Terwijl meer traditionele TL calcium beeldvormende methoden gebruiken GCaMPs (GFP gefuseerd met calmoduline) of FRET (GVB en YFP gefuseerd met calmoduline) hebben bewezen nuttige technieken verstrekken van goede ruimtelijke en temporele resolutie te zijn, het onderliggende proces van licht excitatie wekt een aantal beperkingen op de experimentele toepassingen. Vanwege de aard van het excitatie licht, autofluorescentie, foto-bleken en fototoxiciteit onvermijdelijk worden geproduceerd die dientengevolge beperkt de diepte van de structuren die kunnen worden afgebeeld, de duur van de opnames en de continuïteit van real time opname. Met andere woorden, opnamen moeten vaak intermitterend uitgevoerd om de ongewenste bijwerkingen te voorkomen.
Vanwege deze problemen zijn aanvullende alternatieve calcium beeldvorming ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende methoden bioluminescentie beeldvorming, die berust op licht geproduceerd door een enzymatische reactie na calcium binding. Bioluminescent beeldvorming niet licht excitatie vereisen en dus niet dezelfde problemen als conventionele calcium imaging ervaren. Het bioluminescente reporter aequorine – geïsoleerd uit Aequorea victoria, dezelfde kwal waaruit GFP werd isolated- bindt calcium via de drie EF kant structuren en ondergaat een vormverandering, die leidt tot de oxidatie van de coelenterazine cofactor en de vrijlating van blauw licht (λ = 469 nm) 2,3. Aequorine heeft een lage affiniteit voor calcium (Kd = 10 uM) dat ideaal toezicht calcium transiënten omdat het zeer weinig ruis en niet interfereert met het intracellulaire calcium buffersysteem 4 maakt. Hoewel aequorine eerder is gebruikt om het proces van neurale inductie monitoren de Xenopus ei 5 het geproduceerde licht is te zwak om te gebruiken voor real time imaging van neuronale activiteit. In een poging om deze uitdaging, Philippe Br & pakken# 251; laat en collega's bij het Instituut Pasteur creëerde een genetisch construct fuseren GFP en aequorine genen, het nabootsen van de inheemse staat binnen de kwallen 4. Dit fusiegen product bindt calcium weer via de drie EF kant structuren van aequorine, waarbij een conformationele verandering die leidt tot oxidatie van coelenterazine, welke energie niet radiatief overdraagt aan de GFP ondergaat. Deze energieoverdracht resulteert in het vrijkomen van groen licht (λ = 509 nm) van GFP, in plaats van blauw licht van aequorine. De fusie van GFP en aequorine verleent ook een grotere eiwitstabiliteit helpen het fusie-eiwit te produceren licht 19-65 keer helderder dan alleen 4 aequorine. Met een bioluminescente benadering in de hersenen breidt de huidige experiment met calcium beeldvorming zowel wat de duur van continue registratie en het aantal structuren binnen de hersenen die kan worden opgenomen. In grote lijnen in de context van eerder werk betekent dat zowel globale en meerverscheidenheid van geregionaliseerde "activiteit" van de hersenen kan worden bewaakt (door de proxy van calcium transiënten). Belangrijker kan worden geregistreerd langer, in real time en continu, die gemakkelijk leent voor de uitoefening van een volledig begrip van basale functie in de hersenen.
In de laatste jaren hebben ons laboratorium en anderen transgene vliegen expressie brengen van het GFP-aequorine onder de controle van de binaire expressiesysteem (GAL4 / UAS-GFP-aequorine) 5,6 ontwikkeld. We hebben gebruik GFP-aequorine bioluminescentie naar record activiteit door natuurlijke stimuli zoals geur 7,8, en bestudeerden de cellulaire componenten modulerende Ca2 + -activity de mushroom bodies volgende acetylcholine receptor stimulering door directe nicotinezuur toepassing 9. Daarnaast hebben we ook GFP-aequorine een aantal experimentele vragen die niet in staat zijn eerder gericht, zoals langdurige pakkenbeeldvorming van spontane calcium transiënten en visualisatie van diepere hersenstructuren 10. Recenter hebben we de GAL4 / UAS systeem om de zoogdierlijke ATP receptor P2X 2 11 een kation kanaal in de projectie neuronen (PN) expressie en gebruikt het LexA systeem GFP-aequorine in de champignon organen expressie (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (een hoffelijkheid van B. Pfeiffer, Janelia Boerderij, Verenigde Staten). Daardoor hebben we de PN activeren toepassing van ATP, dat op zijn beurt activeert de champignon organen (een stroomafwaarts doel van de PN), nabootsen meer natuurlijke omstandigheden, zoals de respons op een stimulus geur. Overall deze techniek combineren P2X 2 en GFP-aequorine breidt de experimentele mogelijkheden. In grote lijnen biedt de mogelijkheid om de activiteitspatronen beter inzicht in de hersenen, het initiëren van nieuwe studies over verschillende stimuli en perturbaties de basale patronen van activiteit kan veranderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het recent ontwikkelde bioluminescente gebaseerde GFP-aequorine benadering hier gepresenteerde maakt in vivo functionele opname van Ca2 + -activity verschillende neuronen, alsmede indien gewenst, in andere soorten cellen zoals bruine stellaatcellen zoals in Cabrero et al. 2013 5.
Modificaties, trouble shooting, extra componenten en kritische stappen
Drosophila Veehouderij …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
