Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной
Summary
Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.
Abstract
Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.
Introduction
Тканях десны окружают человека и мыши зубной и постоянно подвергаются комплексной биопленки зуба 1. Сеть иммунной клетки полицейской десневого барьер жизненно важно для поддержания целостности тканей, обеспечивая гомеостаз с местными микробами синантропных и, в то же время, обеспечивая эффективный иммунитет против патогенного вызов 2. Для достижения гомеостаза, иммунная система тщательно адаптировать к десневой среды, создающей высоко специализированной сети иммунных клеток, пока известно мало подробностей известно о десневых популяциях клеток иммунной системы и их роль в поддержании тканей иммунитет 2.
Когда иммунного гомеостаза нарушается на десны, либо через повышенной восприимчивости хозяина и / или в присутствии дисбиотических микробных сообществ, воспалительного состояния, периодонтит возникает 3 4. Пародонтит является распространенным воспалительным заболеванием, что приводит к потере зуба сupporting структуры. В своих тяжелых формах она наблюдается примерно 10% от общей численности населения 5. Анатомический ключевые факторы, влияющие на периодонтита восприимчивости и прогрессирования оказалось трудным 6. Тем не менее, модели на животных были чрезвычайно полезны в понимании механизмов инициации пародонтита и прогрессирования 7. Модели могут быть использованы для определения ключевых клеточных популяций и молекулярные медиаторы, которые имеют жизненно важное значение для поддержания иммунного гомеостаза и развитие привода пародонтоза. Такое понимание превратит наше понимание десны конкретных контроля иммунного гомеостаза и углубить наше нынешнее понимание патогенеза заболевания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тока методика успешно дает большое количество иммунных клеток (от одной мыши) подходит не только для фенотипического описания, но также и для функциональных исследований экс виво. Другая группа ранее опубликованные протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать иммунные клетки ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.
Materials
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3mL |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 mL FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., & Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., & Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I. Et Al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., & Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., & Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology / Edited By John E. Coligan … [Et Al.]. Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M. Et Al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M. Et Al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229ra240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., & Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
