मात्रात्मक Metalloproteomic विश्लेषण के लिए मानक आकार बहिष्करण आईसीपी एमएस का उपयोग

Summary

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Abstract

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Introduction

आवश्यक धातुओं माध्यमिक दूत रास्ते, चयापचय रास्ते और organelle कार्यों सहित सामान्य जैविक कार्यों, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सभी प्रोटीन का 30% metalloproteins ¹ और सभी एंजाइमों ² का 50% माना जाता है। Metalloenzymes सहकारकों, रासायनिक प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित, प्रोटीन संरचना को स्थिर करने के रूप में इस तरह के और माध्यमिक दूत के रूप में नियामक की भूमिका निभाने के लिए इन धातुओं का पता लगाने का उपयोग करें। Neurodegeneration के संबंध में सबसे अधिक अध्ययन तत्वों का पता लगाने के कुछ तांबा, लोहा और जस्ता ³ रहे हैं। वे कई रोग रास्ते में शामिल होने की जहां dyshomeostasis द्वारा प्रतिकूल प्रभावित हो सकता है लगा रहे हैं। उदाहरण के लिए सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) सीधे प्रभाव जीवन काल और Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस) ⁴ के पारिवारिक प्रकार की ट्रांसजेनिक चूहों मॉडल के phenotype की धातु की स्थिति। अल्जाइमर रोग में metalloproteomics तकनीक पी में transferrin की धातु स्थिति में कमी की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैLāsma ^5। इन अध्ययनों से महत्वपूर्ण भूमिका metalloproteins रोग में खेल सकते हैं पर प्रकाश डाला।

जैविक ऊतकों से सीधे metalloproteins के अध्ययन के लिए एक विकासशील क्षेत्र है। हालांकि कुछ metalloenzymes विशेषता किया गया है, बहुमत अभी भी uncharacterized या अज्ञात ⁶ रहते हैं। मापने metalloproteins में प्रमुख चुनौतियों में से एक आवश्यकता प्रोटीन ⁷ के देशी राज्य बनाए रखना है। शास्त्रीय बॉटम-अप प्रोटिओमिक तकनीक पेप्टाइड में प्रोटीन का पाचन पर भरोसा करते हैं। इस प्रक्रिया धातुओं और उनके प्रोटीन की गैर सहसंयोजक बातचीत बाधित। इस प्रकार, एक प्रोटीन की धातु की स्थिति के बारे में कोई जानकारी प्राप्त की है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री ^8,9 (एसईसी-आईसीपी एमएस) – एक तरह से इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा के साथ रखा उपयोग कर रहा है। इस प्रोटीन के अनुमानित आकार के बारे में जानकारी के साथ ही किसी भी धातुओं कि एसोसिएटेड हैं उत्पन्न करता हैयह ^{10 के} साथ iated। इसके अलावा, आकार अपवर्जन एक सज्जन chromatographic तकनीक है कि एक एंजाइम या प्रोटीन, प्रोटीन परिसर के देशी राज्य की रक्षा कर सकते है। उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा का उपयोग करने का एक लाभ यह है – मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी एमएस) प्रौद्योगिकी के मात्रात्मक प्रकृति है। Metalloproteins मानकों का एक सेट का उपयोग कर इसे जैविक नमूने ^9,11 से metalloproteins का पूर्ण quantitation प्रदान करने के लिए संभव है। यह धातु सांद्रता का एक सीमा से अधिक जाना जाता metalloproteins इंजेक्शन लगाने के द्वारा एक मानक वक्र उत्पन्न करके हासिल की है।

इस प्रोटोकॉल यह कैसे metalloprotein मानकों की एक किस्म के लिए प्राप्त किया जा सकता का एक उदाहरण दिखाता है। इस पत्र में हम लोहा (Fe), तांबा (कॉपर), जस्ता (जिंक), आयोडीन (आई), और कोबाल्ट (सह) सहित धातुओं कि बड़े पैमाने पर जैविक खेतों में जांच कर रहे हैं के लिए मानक घटता पैदा करना है।

Protocol

1. बफ़र और नमूनों की तैयारी बफर के 500 मिलीलीटर, 200 मिमी अमोनियम नाइट्रेट पीएच 7.6 तैयार – 7.8 (पीएच अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (एनएच 4 OH) के साथ समायोजित) सीज़ियम (सीएस) के साथ और ही विरोधाभास (एसबी) 10 पीपीबी के अंतिम एकाग्रता के लिए कहा। आईसीपी एमएस के जवाब में किसी भी बहाव के लिए नजर रखने के लिए आंतरिक मानकों के रूप में सीज़ियम और विरोधाभास का प्रयोग करें। फ़िल्टर बफर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उपयोग करने से पहले। तरल, ऊतक या सेल संस्कृति: नमूना के प्रकार पर निर्भर नमूना तैयार करें। नमूने है कि homogenization (जैसे, ऊतक या सेल) की आवश्यकता होती है, यह सुनिश्चित करें कि वे डिटर्जेंट शामिल नहीं है। नमूना तैयार करने के लिए Tris बफ़र्स का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, फॉस्फेट buffers उपयोग करें, लेकिन वे नकारात्मक समय के साथ या फ्रीज पिघलना चक्र 12 के साथ metalloproteome प्रभावित कर सकते हैं। का उपयोग कर Tris खारा बफर (50 मिमी Tris पीएच 8.0 5 मिनट, 150 मिमी सोडियम क्लोराइड के लिए मैनुअल Dounce या sonication द्वारा ऊतक या सेल संस्कृति के नमूने Homogenize(NaCl) + ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) मुक्त protease inhibitors)। 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर centrifugation द्वारा homogenates स्पष्ट करें। जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला लीजिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें। नोट: सभी नमूनों से पहले उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में लोड (एचपीएलसी) शीशियों आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) स्तंभ अवरुद्ध से विविक्त को रोकने के लिए centrifuged किया जाना चाहिए। प्रोटीन की कुल राशि के नमूने भर स्तंभ पर लोड मानक के अनुसार। एक सूक्ष्म मात्रा यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 13 का उपयोग कर 280 एनएम पर प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं। 20 और 150 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन के बीच लोड। नमूना एकाग्रता के आधार पर 80 μl – ठेठ इंजेक्शन 2 से लेकर मात्रा में प्रयोग करें। नमूना लोड करने से पहले आसुत जल के साथ सूक्ष्म मात्रा यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का नमूना हाथ साफ करें। नमूना हाथ जहां प्रोटीन के नमूने लोड कर रहे है। वें में से 2 μl के खिलाफ खाली साधनई नमूना बफर। फिर, हाथ पर प्रत्येक नमूने की लोड 2 μl और 280 एनएम पर absorbance के उपाय। सांद्रता निर्धारित करते हैं। क्रूड प्रोटीन के नमूने लिए, 1 पेट = 1 मिलीग्राम / एमएल के एक विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करें। नमूनों में प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, बीयर-लैम्बर्ट कानून, एक = ε xlxc, जहां एक absorbance है, ε विलुप्त होने के गुणांक है का उपयोग करें, एल सेंटीमीटर में पथ की लंबाई है और सी एकाग्रता है। 2. Metalloprotein मानकों के थोक विश्लेषण उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा का उपयोग करना – मास स्पेक्ट्रोमेट्री वार्म अप और धुन निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग साधन। एक बार जब साधन गरम और देखते है, थोक आईसीपी एमएस प्रदर्शन करते हैं। नोट: शुद्ध metalloproteins के शेयर समाधान आम तौर पर माप से पहले पतला करने की जरूरत है। धातु stochiometries और अनुमानित प्रोटीन concentra: मानक के धातु एकाग्रता में जाना जाता प्रोटीन से अनुमान लगाया जा सकता हैtion। यह जानकारी कमजोर पड़ने कि उत्पन्न मानक वक्र की सीमा के भीतर गिर करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Metalloprotein मानकों, thyroglobulin, ferritin, ceruloplasmin, घन / Zn वतन और विटामिन बी 12 पतला, यह सुनिश्चित करने के लिए वे 0 की श्रेणी में आते हैं – 500 माइक्रोग्राम / एल, 1% नाइट्रिक एसिड का उपयोग कर। इस सीमा के भीतर मानकों को प्राप्त करने के लिए, 20 में 1 से अधिक dilutions उपयोग नहीं करते हैं, यदि आवश्यक हो इस से पहले शेयरों को कमजोर करने के लिए पानी में धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। इंजेक्शन के आदेश को निर्धारित करें। सबसे पहले, सात अंशांकन स्तर का विश्लेषण, 0 से लेकर सांद्रता – 500 माइक्रोग्राम / एल, metalloprotein मानकों के द्वारा पीछा किया। सात अंशांकन स्तरों 0, 1, 5, 10, 50, 100 और 500 माइक्रोग्राम / एल कर रहे हैं। ब्याज के तत्वों का चयन करें। यहाँ, फे, घन, Zn, सीओ और मैं प्रयोग के रूप में वे तत्व है कि प्रोटीन मानकों के लिए बाध्य कर रहे हैं। तत्व चयनकर्ता टैब खोलने और Eleme जोड़कर अधिग्रहण विधि में तत्वों का चयन करें एनटीएस और उनके संबंधित आइसोटोप जनता कर रहे हैं कि विश्लेषण किया जा सके। साधन के साथ नमूना विश्लेषण करते हैं और साधन सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से बनाता तत्वों में से प्रत्येक के लिए अंशांकन घटता विश्लेषण किया जा रहा है। अंशांकन घटता धातु धातु की राशि है कि मानक शामिल करने का मतलब है माइक्रोग्राम / एल में, के खिलाफ पता चला की गिनती / सेकंड की साजिश रचने के सॉफ्टवेयर द्वारा बनाई गई हैं। अज्ञात नमूनों में धातु की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए अंशांकन घटता का प्रयोग करें। नोट: अंशांकन वक्र का उपयोग, सॉफ्टवेयर metalloprotein मानकों में से प्रत्येक में धातु की एकाग्रता निर्धारित करता है। थोक विश्लेषण के परिणाम से, metalloprotein मानकों कि घन का एक मिश्रण का उपयोग स्तनधारी ऊतकों में तीन सबसे प्रचुर मात्रा में तत्वों का पता लगाने में शामिल उत्पन्न, Zn सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) एक फाइनल में 200 माइक्रोग्राम / कॉपर और जिंक और ferritin (FTN) के एल को पतला 2,000 माइक्रोग्राम / लोहे के एल की एकाग्रता। jove_title "> 3। एचपीएलसी सिस्टम सेटअप और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी स्तंभ संतुलन नोट: इस खंड में, पिछले करने के लिए समानांतर में किया जाना चाहिए, क्योंकि वे दोनों के बारे में 1 की आवश्यकता – पूरा करने के लिए 1.5 घंटे। शुद्ध एचपीएलसी 1.1 चरण में किए गए बफर के साथ पंप और 5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर 5 मिनट के लिए पंप शुद्ध करना। एक बार इस प्रणाली पर्ज है, 0.1 मिलीग्राम / मिनट पर प्रवाह की दर निर्धारित करने और आकार अपवर्जन स्तंभ (4.6 x 300 मिमी, 3 माइक्रोन, 150 ए) कनेक्ट। नोट: ट्यूबिंग और स्तंभ के बीच एक गीला कनेक्शन से बचा जाता है किसी भी हवाई बुलबुले स्तंभ के कनेक्शन के दौरान फंसाया जा रहा है। यूवी डिटेक्टर 280 तिरछी ट्यूबिंग का उपयोग कर एनएम पर absorbance को मापने के लिए स्थापित करने के लिए स्तंभ के विपरीत छोर से कनेक्ट। धीरे-धीरे 0.05 की वेतन वृद्धि में स्तंभ के प्रवाह की दर में वृद्धि – 0.4 मिलीलीटर की एक अंतिम प्रवाह की दर तक 0.1 मिलीग्राम / मिनट / मिनट तक पहुँच जाता है। हालांकि यह हो रहा है, किसी भी लीक के लिए स्तंभ के लिए ट्यूबिंग कनेक्शन की जाँच करें। दबाव की निगरानीप्रणाली के सुनिश्चित करने के लिए यह सॉफ्टवेयर में वर्णलेख पर दबाव का पता लगाने को देख कर स्तंभ आवश्यकताओं से अधिक नहीं है। स्तंभ छोड़ दो से अधिक 5 आवश्यक प्रवाह दर से संतुलित करने के लिए – 10 कॉलम संस्करणों। के बाद यह equilibrated है, कनेक्ट उपकरणों नमूना विश्लेषण के लिए होते हैं की अनुमति है। 15 मिनट के लिए 0.4 मिलीग्राम / मिनट पर स्तंभ पर बफर एक पंप करने के लिए एचपीएलसी विधि को सेट करें। 4. स्थापना और आकार बहिष्करण चल रहा है – उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा – मास स्पेक्ट्रोमेट्री नोट: संचालन प्रक्रियाओं के साधन और मॉडलों के बीच भिन्न हो सकते हैं। साधन तकनीकी विशेषज्ञ से संपर्क करें कैसे विन्यस्त करने के लिए आईसीपी एमएस इस्तेमाल किया जा रहा बारे में और अधिक जानने के लिए। हार्डवेयर सेटिंग बदलने से पहले स्टैंडबाई मोड में एमएस – आईसीपी रखें। एक बार जब स्टैंडबाई मोड में, ऑटो पारखी के लिए संचार बंद कर देते हैं और नमूना शुरूआत करने के लिए "अन्य" बदल जाते हैं। नोट: सॉफ्टवेयर और कड़ी मेहनत पर निर्भर करता हैबर्तन विन्यास का चयन एक नमूना परिचय स्रोत के रूप में "एचपीएलसी" का इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि यह विकल्प उपलब्ध है जानने के लिए साधन तकनीकी विशेषज्ञ से संपर्क करें। सीधे आईसीपी एमएस पर छिटकानेवाला के लिए यूवी डिटेक्टर से बाहर प्रवाह कनेक्ट करने के लिए तिरछी ट्यूबिंग (आईडी 0.13 मिमी) का प्रयोग करें। पावर आईसीपी का बैक अप – एमएस और साधन 10 के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं – 20 मिनट। एचपीएलसी autosampler के पीछे करने के एमएस – बाद प्लाज्मा प्रज्वलित है, आईसीपी से दूरदराज के केबल को जोड़ने। एक बार प्लाज्मा प्रज्वलित है यह मत करो; अन्यथा एचपीएलसी प्रणाली स्वतः आईसीपी के बाद से बंद हो जाएगा – एमएस पर नहीं है। नियंत्रण रेखा आईसीपी एमएस के लिए डेटा इकट्ठा करने के लिए आईसीपी एमएस विधि बदलें। समय संकल्प अधिग्रहण (टीआरए) के लिए स्पेक्ट्रम से अधिग्रहण विधि में परिवर्तन। तत्वों का चयन करने के लिए विश्लेषण किया, फे, घन, Zn, सह, मैं के रूप में अच्छी तरह से ब्याज की किसी भी अन्य तत्वों, और एकीकरण के समय निर्धारित (आम तौर पर 0.05 के बीच – 0.3 सेकंड)। ब्याज के तत्वों के बादफिर से चुना है, अधिग्रहण के समय क्रोमैटोग्राफी के लिए चलाते समय मैच के लिए समायोजित (जैसे, एक 15 मिनट के क्रोमैटोग्राफी रन के लिए 900 सेकंड)। मैन्युअल धुन आईसीपी – संवेदनशीलता और टक्कर सेल हीलियम के लिए एमएस (वह) क्रोमैटोग्राफी बफर का उपयोग सीएस और एस.बी. बफर में शामिल बहने के साथ गैस प्रवाह दरों। उन्होंने कहा कि प्रवाह की दर आमतौर पर ~ 1 मिलीग्राम / मिनट थोक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की तुलना में कम कर रहे हैं। एक बार जब धातु आयन मायने रखता है स्थिर है और रिश्तेदार मानक विचलन (आरएसडी) मूल्यों 5% से नीचे हैं, इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए तैयार है। दोनों एचपीएलसी और आईसीपी एमएस सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में नमूना चलाने सूची बनाओ। नमूना रन सूची जिस क्रम में नमूने के प्रत्येक नाम है जिसके द्वारा डेटा सहेजा जाएगा और साथ ही इंजेक्शन जा रहा है शामिल हैं। कि दोनों कार्यक्रमों के बीच सूची मैच में नमूनों की कुल संख्या की जाँच करें। एचपीएलसी पहले आईसीपी एमएस के लिए नमूना बैच, HPLC द्वारा नमूना के इंजेक्शन के रूप में शुरू आईसीपी ट्रिगर किया जाएगा – संग्रह शुरू करने के लिए एमएसजानकारी। यदि यह सही क्रम में नहीं किया जाता है यह याद आ रही डेटा में परिणाम होगा। 6000 माइक्रोग्राम / एल वतन और 200 माइक्रोग्राम / एल से FTN मिश्रित मानक के अलग मात्रा में इंजेक्शन द्वारा अंशांकन वक्र अंक उत्पन्न फे के लिए 60,000 माइक्रोग्राम / एल के लिए घन और ZN और 2,000 माइक्रोग्राम / एल अप के लिए स्तंभ पर इंजेक्शन। इंजेक्शन की मात्रा 1 से 30 μl को लेकर। नोट: ये एकाग्रता पर्वतमाला फ़े, कॉपर और जिंक की सांद्रता आम तौर पर जटिल homogenates में मनाया धरना। नमूने है कि केवल शुद्ध प्रोटीन होते हैं के लिए वक्र की अधिकतम सीमा के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। प्रोटीन के साथ जुड़े के बाद से वहाँ अन्य कारकों से नमूने में कम प्रदूषण को है एक छोटे या बड़े रेंज की आवश्यकता हो सकती धातु की राशि के रूप में। अज्ञात नमूने ऊतक, प्लाज्मा या सेल संस्कृति से प्रत्येक का विश्लेषण। 5. डेटा विश्लेषण, हेरफेर और दृश्य अल्पविराम से अलग मूल्य में डेटा (CSV) फ़ाइल स्वरूप स्टोर और मैं लोडNto संसाधन प्रोग्राम के रूप में आवश्यक। आदेश साधन बहाव के लिए नियंत्रित करने के लिए, या तो सीएस या SB के लिए प्रति सेकंड की गिनती के द्वारा प्रत्येक तत्व के लिए प्रति सेकंड की गिनती के विभाजित। तत्वों में से प्रत्येक के लिए अंशांकन घटता उत्पन्न करता है। धातु चोटी कि metalloprotein है कि यह वरीयता प्राप्त डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में चोटी के एकीकरण के प्रदर्शन से इंजेक्शन से प्रत्येक के लिए के लिए बाध्य है से मेल खाती है के तहत क्षेत्र का निर्धारण करते हैं। फे के लिए 60,000 माइक्रोग्राम / एल – 6000 माइक्रोग्राम / घन और Zn और 2,000 के लिए एल – धातु की कुल राशि है कि हर समय में स्तंभ पर इंजेक्ट किया गया था, 200 के खिलाफ धातु चोटी के तहत क्षेत्र प्लॉट। सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल के अनुसार रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण करते हैं। एक कारक के रूप में रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण से ढलान परिणामों का उपयोग करें पीजी / सेक करने के प्रति दूसरे मायने रखता है परिवर्तित करने के लिए। लाइन मूल्य की ढाल से वर्णलेख भर में दूसरी डेटा बिंदुओं प्रति गिनती के प्रत्येक फूट डालो। में डेटा ग्राफस्नातकोत्तर / वर्णलेख समय के खिलाफ सेकंड। ब्याज की चोटियों के तहत क्षेत्र का निर्धारण करते हैं। चोटी के तहत क्षेत्र धातु है कि प्रोटीन पीजी में करने के लिए बाध्य किया जाता है, की कुल राशि का प्रतिनिधित्व करता है। नाम से जाना जाता metalloproteins और समय जिस पर वे elute की आणविक वजन के आधार पर एक अंशांकन उत्पन्न करता है। इस का प्रयोग करें जटिल नमूने में प्रोटीन चोटियों के आकार का अनुमान है।

Representative Results

Metalloprotein मानकों का उपयोग आकार अपवर्जन स्तंभ की जांच के लिए अनुमति देता है। चित्रा 1 ए के लिए क्षालन प्रोफ़ाइल से पता चलता मानकों thyroglobulin, ferritin, ceruloplasmin, घन / Zn वतन और विटामिन बी 12 धातु है कि वे करने के लिए बाध्य कर रहे हैं पर आधारित (फ़े, सह, घन, Zn और मैं)। चित्रा 1 बी आकार अपवर्जन प्रोटीन मानकों की आणविक वजन और उनके क्षालन समय पर आधारित स्तंभ के लिए अंशांकन वक्र, क्षालन मात्रा का प्रारूप (ve में प्रस्तुत) के शून्य मात्रा से विभाजित चलता स्तंभ (Vo)। इस मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं प्रोटीन concanavalin ए, conalbumin, ceruloplasmin, ferritin, वतन और thyroglobulin। स्तंभ पर इंजेक्शन फे के 60,000 स्नातकोत्तर और चित्रा 2 डी पी प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग किया जाता है – चित्रा 2A 2,000 की एक सीमा से अधिक ferritin की क्षालन से पता चलताeak क्षेत्र। आंकड़े 2 बी और -2 सी घन और Zn और 2 ई और 2 एफ के लिए घन / Zn वतन के लिए क्षालन प्रोफाइल प्रतिगमन शिखर क्षेत्रों का उपयोग कर उत्पन्न विश्लेषण कर रहे हैं। प्रतिगमन विश्लेषण के परिणाम पीजी / सेक करने के लिए मायने रखता है / सेकंड कच्चे डेटा परिवर्तित करने के लिए इतना प्रोटीन के साथ जुड़े धातु की राशि मात्रात्मक निर्धारित किया जा सकता उपयोग किया जाता है। रूपांतरण रेखीय प्रतिगमन (जैसे, 334.6 (मायने रखता है / सेक) एक्स (सेकंड / तांबे का पीजी)) की ढलान से मायने रखता है / सेकंड विभाजित करके किया जाता है। जैसा कि कहा गया है, इस तकनीक जटिल जैविक नमूने में metalloproteins की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मानव मस्तिष्क और प्लाज्मा इस तकनीक के अधीन कर दिया गया है और आंकड़े 3 और 4, क्रमश: प्राप्त परिणाम बताते हैं। मानव मस्तिष्क एसईसी-आईसीपी एमएस द्वारा अलग आंकड़े 3 ए -3 सी में दिखाया गया है, जिनमें से प्रत्येक का एक अलग धातु का प्रतिनिधित्व ब्याज (कॉपर, जिंक या फ़े)। आंकड़े -4 ए-4C निशान प्राप्त दिखाने के लिए जब मानव प्लाज्मा इस तकनीक के अधीन है। जटिलता और नमूना की बहुतायत चोटियों में देखा जाता है कि की संख्या पर असर पड़ेगा। उम्मीद प्लाज्मा ceruloplasmin और transferrin सहित कुछ metalloproteins का प्रभुत्व है के रूप में। चित्रा 1. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के कैलिब्रेशन -। Metalloprotein उनके संबंधित धातुओं पर आधारित मानकों के लिए जाना metalloproteins (ए) क्षालन प्रोफ़ाइल का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री – Inductively प्लाज्मा युग्मित। (बी) प्रोटीन मानकों thyroglobulin (i), ferritin के लिए आण्विक वजन अंशांकन वक्र (द्वितीय), ceruloplasmin (iii), conalbumin (iv), घन / Zn वतन (v) और concanavalin ए (vi)।"लक्ष्य =" _blank "> यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें। 60,000 माइक्रोग्राम / एल – घन, फे या metalloproteins साथ Zn एसोसिएटेड की राशि एक जटिल जैविक नमूना में इंजेक्शन रेंज 2,000 से अधिक ferritin के लिए (ए) क्षालन प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए चित्रा 2. ferritin और Metalloprotein मानक के रूप में घन / Zn वतन का प्रयोग करें। लोहे की। (बी) और (सी) 200 के इंजेक्शन सीमा से अधिक घन / Zn वतन के लिए क्षालन प्रोफ़ाइल – 6000 माइक्रोग्राम / तांबा और जस्ता क्रमश: एल। (डी), (ई) और (एफ) धातुओं लोहा, तांबा और जस्ता के लिए प्रतिगमन विश्लेषण के परिणाम बताते हैं, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <p class="Jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> चित्रा 3. घन, फे और मानव मस्तिष्क। (ए) कॉपर ट्रेस (बी) आयरन का पता लगाने के Zn Metalloproteome (सी) जिंक ट्रेस। प्रत्येक धातु के लिए प्रोटीन मानकों का क्षालन उनके आणविक वजन ग्राफ के संकेत के साथ काले रंग का पता लगाने के द्वारा दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4. घन, फे और Zn Metalloproteome मानव प्लाज्मा के लिए। (ए) कॉपर ट्रेस (बी) के लौह ट्रेस (सी) जिंक ट्रेस। प्रत्येक धातु के लिए प्रोटीन मानकों का क्षालन में उनके आणविक वजन के साथ काले रंग का पता लगाने के द्वारा दिखाया जाता हैग्राफ के तहत dicated। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटीन के देशी राज्य यह सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया और नमूने के भंडारण की जरूरत है बफ़र्स पर विशेष ध्यान का मतलब है। सभी क्रोमैटोग्राफी तकनीक या नमूना तैयार करने की तकनीक नियोजित किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि नमूना तैयार करने और क्रोमैटोग्राफी भर में इस्तेमाल किया बफ़र्स धातु chelators और उपयोग buffers कि शारीरिक पीएच और नमक सांद्रता की नकल से रहित हैं। अन्य स्थितियों से बचने के लिए हीटिंग नमूना या प्रोटीन denaturants (जैसे, यूरिया) के अलावा शामिल हैं। यह फ्रीज पिघलना चक्र की संख्या को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। द्विसंयोजक धातुओं बाँध करने के लिए चुना बफर की क्षमता भी महत्वपूर्ण है और एक कारण यह है कि Tris या अमोनियम नाइट्रेट बफ़र्स फॉस्फेट आधारित बफ़र्स पर चुना जाता है।

क्रोमैटोग्राफी के अन्य रूपों को आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी रिश्तेदार के कम संकल्प और शिखर क्षमता इस तकनीक का एक प्रमुख सीमा है। हालांकि, आकार अपवर्जन chromatogra की कोमल स्वभावबनावट प्रोटीन के देशी राज्य बनाए रखने के लिए और इस तरह अपेक्षाकृत कमजोर धातु प्रोटीन बांड की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है। आवश्यकता प्रोटीन के देशी राज्य बनाए रखने के लिए, फ्रीज पिघलना चक्र की संख्या को सीमित सहित नमूने के उपचार के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता धातु chelators (जैसे, EDTA) या chaotropic लवण और डिटर्जेंट से परहेज।

इस तकनीक के प्रभावों की यह कम संकल्प एक विशिष्ट प्रोटीन के साथ जुड़े धातु की राशि यों के लिए अगर यह चोटियों देखा और फिर एक प्रोटीन होते हैं जाएगा के रूप में एक जटिल नमूने में है क्षमता। इसलिए, धातु की राशि चोटी एकीकरण का उपयोग निर्धारित प्रोटीन के सभी इस समय बिंदु पर एल्यूटिंग और न सिर्फ एक विशेष प्रोटीन के साथ जुड़े धातु की कुल राशि का एक संकेत होगा। आदेश में इस सीमा को पार करने के लिए ब्याज की प्रोटीन आगे मूल निवासी की शर्तों के तहत शुद्ध करना होगा। इस की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति होगीइस प्रोटीन के साथ जुड़े धातु certainity के एक उच्च डिग्री के साथ सूचित किया जा सके। इस तकनीक का एक अन्य संभावित सीमा स्तंभ को गैर बाध्यकारी प्रतिवर्ती के कारण प्रोटीन का नुकसान होगा। आदेश है कि अगर यह एक वसूली प्रयोग हो रहा है निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए जिससे प्रोटीन स्तंभ बंद एल्यूटिंग की राशि यदि इस राशि का इंजेक्शन मैच निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया है। एक ही क्षालन सामग्री की धातु सामग्री और थोक आईसीपी एमएस द्वारा शुरू सामग्री को मापने के द्वारा किया जा सकता है। कॉलम वसूली का इस्तेमाल किया शर्तों के आधार पर अलग कर सकते हैं, लेकिन यह दिखाया गया है कि एक आकार अपवर्जन स्तंभ से प्रोटीन की पूरी वसूली संभव ⁹ है। इस प्रकार यह या नहीं, वहाँ ऑपरेटिंग शर्तों के तहत किसी भी हानि इस्तेमाल किया जा रहा है की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है।

प्रोटोकॉल में संशोधन metalloprotein कि मानकों का विश्लेषण किया तत्वों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल कर रहे हैं से संबंधित हो सकता है। metalloprotein मानक हमें के प्रकारएड तत्वों है कि ब्याज की हैं पर निर्भर करता है अलग होगा। ऐसे घन, फे और Zn प्रोटीन के रूप में तत्वों के लिए, वतन और ferritin कार्यरत हैं। किसी भी अन्य metalloprotein है कि ज्ञात stoichometries भी इस्तेमाल किया जा सकता है और कुछ उदाहरण यहाँ दिखाया गया है।

एक प्रमुख समस्या है कि इस तकनीक का उपयोग करने से उत्पन्न कर सकते हैं आईसीपी एमएस की मशाल में नमक के क्रिस्टल का निर्माण होता है। कि इस प्रणाली के माध्यम से पारित कर दिया गया है या जब यह दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित किया जाता मशाल धोया जाना चाहिए कि बफर के 1000 मिलीलीटर – नमक क्रिस्टल का निर्माण हुआ रोकने के लिए, मशाल हर 500 के बाद आसुत जल से धोया जाता है। एक अन्य समस्या यह है कि पैदा कर सकते हैं नमूना और निकासी शंकु की साफ-सफाई में एक और अधिक तेजी से गिरावट आई है। ये निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन नियमित रूप से साफ करने की जरूरत है।

प्रारंभिक नमूना तैयार प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। धातु जटिल inf – अगर वहाँ प्रोटीन के लिए किसी भी परिवर्तन कर रहे हैंormation उत्पन्न मान्य नहीं होगा। इस तकनीक के प्रमुख सीमाओं में से एक है; इसके अलावा कम संकल्प का उपयोग करते हैं, आकार अपवर्जन स्तंभ जीव विज्ञान में metalloproteins का सच जटिलता का एक सीमित विस्तृत दृश्य अर्जित करता है।

तकनीक यहाँ वर्णित एक जीव की metalloproteome के ज्ञान के विस्तार की अनुमति देता है। थोक विश्लेषण केवल एक कच्चे एक नमूना भीतर धातु की मात्रा में परिवर्तन का संकेत देता है। सामान्य बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इसके अलावा, इस तकनीक का एक उपकरण है कि प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में पहचान metalloproteins के साथ जुड़े धातु की राशि है कि निशान प्राप्त की तुलना द्वारा अलग quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग रोग राज्यों के बीच मतभेद की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। पहचान metalloproteins फिर आगे की भूमिका वे रोग प्रक्रियाओं में खेलने निर्धारित करने में मदद करने के लिए जांच की जा सकती है। बंटे आईसीपी एमएस के आवेदन एक से बढ़ रही हैभविष्य में इस तरह के ड्रग्स प्लैटिनम, आयोडीन या आईसीपी एमएस के रूप में तांबे के रूप में एक heteroatom है की भूमिका निर्धारित करने के लिए प्रोटीन है कि दवा बांधता की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Materials

Agilent 1290 Infinity Binary Pump	Agilent	G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler	Agilent	G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat	Agilent	G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment	Agilent	G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector	Agilent	G1314E
Agilent 7700 ICP-MS	Agilent	G3282A
Ammonium hydroxide trace metal basis	Sigma	338818
Ammonium nitrate	Sigma	256064	Make fresh 200mM solution on day of experiment
Antinomy	Choice analytical	10002-3
Ceruloplasmin	Sigma
Cesium	Choice analytical	100011-1
Complete, EDTA free protease inhibitors	Roche	11873580001
Conalbumin	Sigma	C7786
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma	L7647
Cu, Zn Superoxide dismutase	Sigma	S9697
Ferritin	Sigma	F4503
ICP-MS multielemental calibration standards	AccuStandard		Made up to required concentrations in 1% nitric acid
Microvolume UV spectrophotometer	Thermo Scientific
65% Nitric acid	Millipore	100441	Diluted to 1% for use
Peek tubing	Agilent	5042-6461
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å	Agilent	5190-2508
Sodium Chloride	Chem Supply	SA046
Tris Hydrochloride	ICN Biomedicals inc.	103130
Thyroglobulin	Sigma	T9145
Vitamin B12	Sigma	V2876