Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
Temel metaller ikincil haberci yollar, metabolizma yolları ve organel fonksiyonları dahil normal biyolojik fonksiyonlar, hayati bir rol oynamaktadır. Tüm proteinlerin% 30 metalloproteinlerdir 1 ve enzimlerin 2% 50 olduğu tahmin edilmektedir. Metalloenzimler, kimyasal reaksiyonları katalize protein yapısını stabilize etmek kofaktör olarak ve ikincil haberciler gibi düzenleyici rolleri için bu iz metalleri kullanın. Nörodejenerasyon getirmedi en çok çalışılan eser elementlerin bazıları bakır, demir ve çinko 3 vardır. Onlar yan etkiler içebileceğiniz dyshomeostasis birçok hastalık yollarıyla ilgili olduğu düşünülmektedir. Örneğin, süperoksit dismutaz (SOD) doğrudan etkiler ömrü ve amiyotrofik lateral sikleroz (ALS) 4 ailesel Çeşidi transgenik fare modellerinde fenotipinin metal durumu. Alzheimer hastalığında, metalloproteomics teknikleri p transferrin metal durumunda bir azalma keşfetmek için kullanılmıştırlasma 5. Bu çalışmalar önemli bir rol metalloproteinlerdir hastalığa oynayabileceği vurgulayın.
doğrudan biyolojik dokulardan Metaloproteinlerde çalışma gelişen bir alandır. Bazı Metalloenzimler, özelliği olmasına rağmen, çoğu hala karakterize edilmemiş ya da 6 bilinmemektedir. Ölçüm Metaloproteinlerde önemli zorluklardan biri proteinin 7 yerli durumunu korumak için bir gerekliliktir. Klasik aşağıdan yukarıya proteomik teknikler peptidler içine proteinlerin sindirimi güveniyor. Bu işlem, metal ve proteinlerin kovalent olmayan etkileşimi bozar. Böylece, bir protein metal durumu hakkında herhangi bir bilgi elde edilir.
Kütle spektrometresi 8,9 (SEC-ICP-MS) – Bu sorunu aşmak için bir yolu ICP ile eşleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi kullanılarak gereğidir. Bu proteinin yaklaşık boyutu hakkında bilgilerin yanı sıra doç hiçbir metaller üretir10 ile iated. Bundan başka, boyut dışlama, bir enzim ya da protein-protein kompleksinin yerli durumunu korumak için hafif bir kromatografik bir tekniktir. indüktif olarak birleştirilmiş plasma kullanmanın bir avantajı, – kütle spektrometrisi (ICP-MS) teknolojisi kantitatif doğasıdır. Metalloproteinlerdir bir dizi standardı kullanarak biyolojik örneklerin 9,11 den Metaloproteinlerde mutlak kantitatif sağlamak mümkündür. Bu, metal bir konsantrasyon aralığı üzerinde bilinen metalloproteinleri enjekte standart bir eğri üretilmesiyle sağlanır.
Bu protokol, bu metalloprotein çeşitli standartlara için elde edilebilir bir örnek göstermektedir. Bu yazıda demir (Fe), bakır (Cu), çinko (Zn), iyot (I) ve kobalt (Co) da dahil olmak üzere, büyük ölçüde biyolojik alanlarda incelenmiştir metaller için standart eğrileri yaratmayı amaçlıyoruz.
Proteinin doğal durumunu sağlanması kullanılan ve örnek depolama gerekli tamponlar özel önem anlamına gelir. Tüm kromatografi teknikleri veya örnek hazırlama teknikleri kullanılabilir değil. Numune hazırlama ve kromatografi boyunca kullanılan tamponlar metal şelatörleri ve fizyolojik pH ve tuz konsantrasyonlarına taklit kullanımı tampon yoksun olması önemlidir. Önlemek için diğer koşullar Isıtma örnek veya protein denatüre edici (örneğin, üre) ilave edilmesini içerir. Donma çözülme döngülerinin sayısını en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. çift değerli metallerin tespit edilmesi için seçilen tampon kabiliyeti önemlidir ve Tris ya da amonyum nitrat tamponlar fosfat bazlı tamponlar içinde seçilen bir nedenidir.
kromatografi diğer biçimlerine boyut dışlama kromatografisi göreceli düşük çözünürlüklü ve pik kapasitesi bu tekniğin önemli bir sınırlama olduğunu. boyut dışlama Kromatografi Bununla birlikte, nazik doğaPHY proteinin doğal durumunu korumak ve böylece görece zayıf metal-protein bağları korumak için önemlidir. Proteinlerin doğal durumunu korumak için gereksinim metal şelat (örneğin, EDTA) veya kaotropik tuzlar ve deterjanlar kaçınarak, donma çözülme döngüsü sayısını sınırlayarak da dahil olmak üzere örneklerin tedaviye özel dikkat gerektirir.
Bu teknik, etkilerin bu düşük çözünürlük daha sonra bir protein içerir görülen tepe gibi kompleks bir örneğinde ise, özel bir protein ile bağlantılı metal miktarını ölçmek için yeteneği. Bu nedenle, en yüksek entegrasyonu kullanılarak saptanmıştır metal miktarı proteinlerinin hepsi sadece belirli bir protein, bu zaman noktasında elüsyon olup ilişkili metalin toplam miktarının bir göstergesi olacaktır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, ilgi konusu olan proteini ayrıca doğal koşullar altında, saflaştırılmış olmak zorunda olacaktır. Bu ölçümü için izinbu protein ile bağlantılı metaller kesinlik arasında daha yüksek bir derece ile raporlanır. Bu tekniğin bir başka potansiyel güçlüğü kolona olmayan geri bağlayıcı proteinin kaybı olur. sütunun elüt protein miktarı, bu enjekte edilen miktar, eşleşip eşleşmediğini belirlemek için analiz edilir ve böylece bu geri deney oluyor olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Aynı elüsyon malzemenin metal içeriğine ve dökme ICP-MS ile başlangıç malzemesinin ölçülerek yapılabilir. Sütun geri kullanılan koşullara bağlı olarak, ancak bir ebat eksklüzyon kolonu proteinlerin tam iyileşme 9 mümkün olduğu gösterilmiştir. Böylece kullanılan çalışma koşulları altında herhangi bir kayıp olup olmadığını kontrol etmek önemlidir.
protokole değişiklikler analiz elemanların yanı sıra, kullanılan metalloprotein standartları ile ilgili olabilir. metalloprotein standardının bize türüed ilgi unsurları bağlı olarak değişecektir. Cu, Fe ve Zn proteinler gibi elemanlar için, SOD ve ferritin istihdam edilmektedir. bilinen stoichometries herhangi bir başka metalloprotein de kullanılabilir ve bazı örnekler burada gösterilmiştir.
Bu tekniği kullanarak ortaya çıkabilir Bir majör komplikasyon ICP-MS meşale tuz kristallerinin birikimi olduğunu. sistem geçirildi edilmiş ya da görsel kontrol altında belirlendiği zaman torç yıkanmalıdır bu tamponun 1,000 ml – tuz kristallerinin oluşumunu önlemek için, fener her 500 sonra damıtılmış su ile yıkanır. ortaya çıkabilir Başka bir problem örnek ve çıkarma koni temizliği daha hızlı bir düşüş olduğunu. Bu üreticinin protokolleri takip düzenli temizlenmesi gerekir.
İlk örnek hazırlama protokolü en kritik adımdır. Metal kompleksi enf – proteine herhangi bir değişiklik varsaormation geçerli olmayacaktır üretti. Bu tekniğin en önemli sınırlamaları biridir; Buna ek olarak düşük çözünürlüklü kullanımı ebat eksklüzyonlu kolon biyolojide metalloprotein gerçek karmaşıklığı sınırlı ayrıntılı bir görünümünü verir.
Burada anlatılan teknik, organizmanın metalloproteome bilgisinin genişletilebilir. Toplu analizi sadece bir örnek içinde metal miktarına değişikliklerin ham gösterge verir. dikkate alınması gereken genel düşünceler Bunun yanı sıra, bu teknik, elde edilen izleri karşılaştırarak farklı protein olarak tanımlayan metalloprotein bağlantılı metal miktarını ölçmek için kullanılabilecek bir araç sağlar. Bu tekniğin kullanılması, hastalık durumlarında arasındaki farkları belirlemek için kullanılabilir. belirlenen metalloproteinlerdir daha sonra da hastalık sürecinde oynadıkları rol belirlemeye yardımcı olmak için araştırılabilir. Hecelenmiş ICP-MS uygulama büyüyen vardırgelecek ilaç bağlayan proteinleri tespit için kullanılabilecek bu tür ICP-MS gibi platin, iyot veya bakır gibi bir hetero sahip ilaçların rolünü belirlemek için.
The authors have nothing to disclose.
Biz Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Agilent Technologies) ile Avustralya Araştırma Konseyi Bağlantı Projeleri Programı, Ruh Sağlığı ve Neuroproteomics Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Victoria beyin bankası, Kooperatif Araştırma Merkezi desteği kabul etmek istiyorum tesis.
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |