चूहे में श्वासनली के रैपिड इंटुबैषेण के लिए एक बेहतर तरीका
Summary
इस लेख के माध्यम से माउस इंटुबैषेण श्वासनली में सीधे bleomycin प्रशासन के लिए एक तेजी से और सरल विधि प्रस्तुत करता है। इस विधि का मुख्य लाभ कर रहे हैं कि यह मास्टर करने के लिए, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए आसान है, और विशेष उपकरण या लंबा वसूली बार की आवश्यकता नहीं है।
Abstract
Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.
Introduction
कुछ संरचनात्मक और शारीरिक मतभेद के बावजूद, 1 murine मॉडल मानव जीव विज्ञान और रोग रोगजनन। 2 मॉडलिंग एक पशुपालन दृष्टिकोण से लिए अमूल्य हो सकता है, चूहों, संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं एक कम प्रजनन के समय, एक त्वरित देता है, और अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे हैं जारी घर। विविध आनुवंशिक तनाव और रणनीतियों (जैसे।, सशर्त तोड़े बहिष्कार, संवाददाता चूहों, वंश अनुरेखण दृष्टिकोण, आदि) के रूप में भी उपलब्ध अभिकर्मकों की व्यापक रेंज (जैसे।, एंटीबॉडी, पुनः संयोजक प्रोटीन, अवरोधकों के विकास के साथ, आदि), चूहों मानव homeostasis और रोग प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए एक आवश्यक मॉडल कशेरुकी जीव बन गए हैं। 3
चूहे गंभीर फेफड़ों की चोट (अली) और फेफड़े फाइब्रोसिस सहित फेफड़े की स्थिति, अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है। मनुष्यों में 4 अली आघात, चोट, या सेप्सिस की वजह से हो सकता है और उपकला के द्वारा होती है औरendothelial रिसाव (यानी।, सूजन), सूजन, और नवजात फाइब्रोसिस। कई रोगियों में, अली अपनी गंभीर रूप, तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS) है, जो अक्सर सांस की विफलता के कारण फाइब्रोसिस और मौत में परिणाम के लिए प्रगति। 5,6 पल्मोनरी फाइब्रोसिस एक प्रगतिशील, घातक विकृति बाह्य मैट्रिक्स से अधिक जमाव के द्वारा होती है सबसे विशेष रूप से टाइप I कोलेजन, बिगड़ा फेफड़ों के समारोह के लिए अग्रणी। bleomycin (BLM) के 7.8 प्रशासन प्रायोगिक पशुओं में अली और फाइब्रोसिस उत्प्रेरण के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है और सबसे अच्छा विशेषता मॉडल है। 9 कृन्तकों में हालांकि BLM प्रेरित करता है फेफड़े फाइब्रोसिस पुनरावृत्ति नहीं पूरी तरह से मानव fibrotic phenotypes, इस मॉडल के साथ 10 माउस के अध्ययन में कई महत्वपूर्ण शुरुआत है और रोग की प्रगति को प्रभावित करने वाले कारकों की खोज हुई है। 11
सटीक व्यवस्था (s) BLM प्रेरित fibrogenesis के पीछे अज्ञात कर रहे हैं, की शुरुआत की चोटका आयोजन एयरवेज और एलवियोली और विशेष रूप से, टाइप 1 pneumocytes अस्तर उपकला कोशिकाओं में संपर्क निर्भर डीएनए किनारा टूट जाता है से उठता है सोचा है। 12 BLM और फेफड़े के उपकला के बीच सीधे संपर्क के लिए जरूरत है एक मजबूत वितरण मार्ग के महत्व पर प्रकाश डाला और इन चिंताओं को भी बाहर का एयरवेज को लक्षित उपचार की एक विस्तृत रेंज, पुनः संयोजक प्रोटीन, एंटीबॉडी, siRNA, वायरस, बैक्टीरिया, विविक्त, और अधिक सहित के लिए सार्थक कर रहे हैं। Oropharyngeal आकांक्षा (OPA) व्यापक रूप से इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है 13 है, लेकिन OPA का एक प्रमुख एक कमी यह है कि जन्म दिया एजेंट के कुछ हिस्से को जठरांत्र पथ में निगल लिया जा सकता है, जिससे प्रशासित खुराक में अस्पष्टता के लिए अग्रणी है। एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण transtracheal टपकाना, जो मजबूत संज्ञाहरण के तहत ट्रेकियोस्टोमी शामिल सीधे श्वास नलिका में श्वासनली और एक एजेंट के टपकाना बेनकाब करने के लिए है। 14 हालांकि, न केवल इस तरह कर सकते हैंएक प्रक्रिया अपने invasivity के कारण अवांछनीय हो सकता है, लेकिन यह भी समय लगता है, प्रशिक्षण के एक निष्पक्ष बिट की आवश्यकता है, और श्वसन तंत्र। 15,16 कई प्रोटोकॉल विकसित किया गया है कि में एजेंटों के प्रत्यक्ष प्रशासन को शामिल करने के लिए एक शक्तिशाली चोट का कारण बनता है शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता के बिना श्वासनली, 16,17,18,19,20 लेकिन इन तरीकों बढ़ाया शामिल वसूली बार शक्तिशाली anesthetics की वजह से, महंगे उपकरण के उपयोग (यानी।, ओटोस्काप / laryngoscope, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रक्रिया बोर्डों, फाइबर ऑप्टिक तार, आदि), मौखिक गुहा में हेरफेर की एक अतिरिक्त है, और अनिश्चितता की खुराक के बारे में।
इस पत्र के माध्यम से इंटुबैषेण प्रशासन के एक अपेक्षाकृत आसान तरीका है कि एक शोधकर्ता जल्दी से, सस्ते में, और मज़बूती से एक अभिकर्मक आसपास के ऊतकों को नुकसान अवशिष्ट की सीमित जोखिम के साथ murine फेफड़ों में टपकाना करने के लिए अनुमति देता है वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
उदाहरण हैं जहां aerosolization सीमित अभिकर्मक उपलब्धता, सुरक्षा, या लागत की वजह से अव्यावहारिक है, प्रत्यक्ष सांस की नली प्रशासन फेफड़ों में exogenous एजेंटों के वितरण के लिए एक बेहतर तरीका है 16 Transtracheal टपकाना व्याप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों trichrome धुंधला और विश्लेषण के साथ मदद के लिए प्रोटोकॉल के ब्रायन जॉनसन और इमेजिंग कोर वाशिंगटन विश्वविद्यालय में धन्यवाद। यह काम एनआईएच अनुदान HL098067 और HL089455 द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | N/A | N/A | |
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2ml Pipettor and Filter Tips | N/A | N/A | |
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | N/A | N/A | See Diagram 1. |
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | N/A | N/A | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | N/A | http://www.highlandmedical.net/ |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis – preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. d. R., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. d. S. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
