Une méthode améliorée pour Rapid intubation de la trachée chez la souris
Summary
Cet article présente une méthode rapide et simple pour l'administration de la bléomycine directement dans la trachée de souris par intubation. Les principaux avantages de cette méthode est qu'il est hautement reproductible, facile à maîtriser, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de longs temps de récupération.
Abstract
Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.
Introduction
En dépit de quelques différences anatomiques et physiologiques, 1 modèles murins continuent à être très précieux pour la modélisation de la biologie humaine et la pathogenèse de la maladie. 2 Du point de vue l'élevage, les souris sont faciles à manipuler, avoir un temps de reproduction faible, une durée de vie accélérée, et sont relativement peu coûteux à la maison. Avec le développement de souches diverses génétiques et stratégies (ex., Knock-out conditionnel, souris rapporteurs, les approches de la lignée de traçage, etc.), ainsi que la large gamme de réactifs disponibles (par ex., Des anticorps, des protéines recombinantes, des inhibiteurs, etc.), les souris sont devenues un organisme modèle vertébré essentiel pour découvrir les processus de l'homéostasie et les maladies humaines. 3
Les souris ont été particulièrement précieux pour l'étude des conditions pulmonaires, y compris les lésions aiguës du poumon (ALI) et la fibrose pulmonaire. 4 ALI chez l'homme peut être causée par un traumatisme, une blessure ou une septicémie et se caractérise par l'épithélium etfuite endothéliale (ie., oedème), l'inflammation et la fibrose naissante. Chez de nombreux patients, ALI progresse à sa forme sévère, syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), ce qui se traduit souvent par la fibrose et de la mort par insuffisance respiratoire. 5,6 La fibrose pulmonaire est une pathologie évolutive fatale caractérisée par le dépôt excessif de matrice extracellulaire , notamment collagène de type I, qui conduit à la fonction pulmonaire. 7,8 administration de la bléomycine (BLM) est le modèle le plus largement utilisé et le meilleur caractérisé pour induire ALI et de la fibrose chez les animaux expérimentaux. 9 Bien que BLM-induit une fibrose pulmonaire chez les rongeurs ne récapituler pas pleinement les phénotypes fibrotiques humains, 10 des études de souris avec ce modèle ont conduit à la découverte de nombreux facteurs importants influant sur l'apparition et la progression de la maladie 11.
Bien que le mécanisme exact (s) derrière fibrogenèse induite BLM-ne sont pas connus, la blessure initiationon pense résultant d'un contact dépendant des brins d'ADN des pauses dans les cellules épithéliales qui tapissent les voies aériennes et les alvéoles, et en particulier, tapez 1 pneumocytes. 12 La nécessité d'un contact direct entre BLM et l'épithélium pulmonaire met en évidence l'importance d'un itinéraire de livraison robuste , et ces préoccupations sont également pertinentes pour un large éventail de traitements ciblés pour les voies aériennes distales, y compris les protéines recombinantes, les anticorps, siRNA, virus, bactéries, particules, et plus encore. Aspiration oropharyngée (OPA) a été largement utilisé à cette fin 13, mais un défaut majeur de l'OPA est qu'une partie de l'agent livré peut être avalé dans le tractus gastro-intestinal, ce qui conduit à l'imprécision de la dose administrée. Une autre approche est largement utilisé instillation transtracheale, ce qui implique une trachéotomie sous anesthésie forte pour exposer la trachée et l'instillation d'un agent directement dans les voies respiratoires. 14 Cependant, non seulement, de tellesune procédure pas souhaitable en raison de son invasivité, mais il est aussi prend du temps, nécessite un peu juste de la formation, et provoque une blessure puissant pour les voies respiratoires. 15,16 Plusieurs protocoles ont été élaborés qui impliquent l'administration directe des agents dans le trachée sans avoir besoin d'une intervention chirurgicale, 16,17,18,19,20 mais ces méthodes impliquent étendues temps de récupération causée par les anesthésiques puissants, l'utilisation d'un équipement coûteux (ie., otoscope / laryngoscope, disponibles dans le commerce planches de procédure, fibre optique fils, etc.), un excès de manipulation dans la cavité buccale, et l'incertitude en ce qui concerne le dosage.
Le présent document décrit une méthode relativement facile de l'administration par intubation qui permet à un chercheur rapidement, à moindre coût, et inculquer de manière fiable un réactif dans le poumon murin avec un risque limité de dommages résiduels aux tissus environnants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les cas où aérosol est impossible, en raison de la disponibilité limitée de réactifs, de la sécurité, ou le coût, l'administration de la trachée directe est une méthode supérieure pour l'administration d'agents exogènes dans les poumons 16 transtrachéale instillation a été largement utilisé à cette fin.; Cependant, comme pour toute intervention chirurgicale, il porte aussi en elle le risque de complications causées par la procédure elle-même, et pas nécessairement l'a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Brian Johnson de l'histologie et Imaging Core à l'Université de Washington de l'aide pour la coloration et l'analyse trichrome. Ce travail a été soutenu par le NIH subventions HL098067 et HL089455.
Materials
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | N/A | N/A | |
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2ml Pipettor and Filter Tips | N/A | N/A | |
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | N/A | N/A | See Diagram 1. |
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | N/A | N/A | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | N/A | http://www.highlandmedical.net/ |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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