En forbedret fremgangsmåte for Rapid intubering av trakea hos mus

Summary

Denne artikkelen presenterer en hurtig og enkel metode for administrering av bleomycin direkte inn i luftrøret mus via intubering. Viktige fordeler med denne metoden er at det er svært reproduserbar, lett å mestre, og krever ikke spesialutstyr eller lange utvinning ganger.

Abstract

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introduction

Til tross for noen anatomiske og fysiologiske forskjeller, ¹ murine modeller fortsette å være uvurderlig for modellering av menneskets biologi og sykdom patogenese. ^{2 Fra} en reindrift synspunkt, mus er lette å håndtere, har en lav avl tid, en akselerert levetid, og er relativt billige til hus. Med utviklingen av ulike genetiske stammer og strategier (f.eks., Betinget knock-outs, reporter mus, avstamning-sporing tilnærminger, etc.), samt det brede utvalget av tilgjengelige reagenser (f.eks., Antistoffer, rekombinante proteiner, hemmere, etc.), har mus blitt en viktig modell virveldyr organisme å avdekke menneskelige Homeostase og sykdomsprosesser. ³

Mus har vært spesielt verdifullt for å studere lungesykdom, inkludert akutt lungeskade (ALI) og lungefibrose. ⁴ ALI hos mennesker kan være forårsaket av traumer, skade eller sepsis og er preget av epitel ogendothelial lekkasje (ie., ødem), betennelse, og begynnende fibrose. I mange pasienter, ALI utvikler seg til sin alvorlige form, akutt lungesviktsyndrom (ARDS), som ofte resulterer i fibrose og død på grunn av respirasjonssvikt. ^5,6 Lunge fibrose er en progressiv, dødelig patologi preget av det overskytende deponering av ekstracellulære matrise , spesielt type i kollagen, noe som fører til nedsatt lungefunksjon. ^7,8 Administrering av bleomycin (BLM) er den mest brukte og best karakteriserte modell for å indusere ALI og fibrose i forsøksdyr. ⁹ Selv om BLM-induserte lungefibrose hos gnagere gjør ikke rekapitulere fullt menneskelige fibrotiske fenotyper, ¹⁰ musestudier med denne modellen har ført til oppdagelsen av mange viktige faktorer som påvirker utbruddet og progresjon av sykdommen. ¹¹

Mens den eksakte mekanisme (r) bak BLM-indusert fibrogenese er ukjente, den initierende skadeantas å oppstå fra kontakt-avhengig DNA trådbrudd i epitelceller lining gjennomfører luftveiene og alveolene, og i særdeleshet, type 1 pneumocytes. ¹² Behovet for direkte kontakt mellom BLM og lunge epitel fremhever viktigheten av en robust levering rute , og disse bekymringene er også relevante for et bredt spekter av behandlinger rettet mot de fjerne luftveiene, inkludert rekombinante proteiner, antistoffer, siRNA, virus, bakterier, partikler, og mer. Orofaryngeal aspirasjon (OPA) har blitt mye brukt for dette formål ^13, men et større en brist av OPA er at noen del av den leverte middel kan svelges i den gastrointestinale kanal, og dermed føre til unøyaktigheter i den administrerte dose. En annen mye brukt metode er transtracheal drypping, som innebærer trakeostomi under kraftig bedøvelse for å eksponere trakea og drypping av et middel direkte inn i luftveiene. ¹⁴ er imidlertid ikke bare kan slikeen prosedyre være uønsket på grunn av sin invasivity, men det er også tidkrevende, krever en god del trening, og fører til en potent skade på luftveiene. ^15,16 Flere protokoller har blitt utviklet som involverer direkte administrasjon av midler inn i luftrøret uten behov for kirurgisk inngrep, ^{16,17,18,19,20} men disse metodene innebærer lengre utvinning ganger forårsaket av kraftige bedøvelsesmidler, bruk av kostbart utstyr (ie., otoskop / laryngoskop, kommersielt tilgjengelige prosedyre boards, fiberoptisk ledninger, etc.), et overskudd av manipulasjon i munnhulen, og usikkerhet med hensyn til doseringen.

Dette dokumentet beskriver en forholdsvis enkel metode for administrering via intubering som gjør at en forsker på en rask, billig, pålitelig og innpode et reagens til murine lungen med begrenset risiko for gjenværende skade på omgivende vev.

Protocol

Institutional Animal Care og bruk komiteer (IACUC) ved University of Washington og Cedars-Sinai Medical Center har godkjent dyret nødvendige arbeidet for disse studiene. 1. Forberedelse Steriliser både den butte enden tang og depressor via autoklav. Ved hjelp av en biologisk sikkerhetskabinett, utarbeide en arbeids lager av BLM i PBS fra frysetørket pulver. Sonikere oppløsningen i 10 min ved 35 kHz for å sikre enda blanding. Merk: Et totalt volum på mellom 30 og 45 ul anbefales …

Representative Results

Intubert mus ble overvåket daglig for vekttap og nød, og ofret 4, 10 eller 17 dager senere via intraperitoneal injeksjon av 2,5% 2,2,2- tribromoethanol. Bronchoalveolar kylling (BAL) ble samlet i tre vasker av PBS som beskrevet andre steder 21 og høyre lunge ble fiksert i 10% formalin, parafin innebygd, og farget med Masson er Trichrome ved University of Washington Histologi og Imaging Core 22. <p class="jove_content" fo:keep-together.within…

Discussion

I tilfeller hvor aerosolisering er upraktisk på grunn av begrenset reagens tilgjengelighet, sikkerhet, eller kostnadene, er direkte tracheal administrering en overlegen metode for levering av eksogene midler i lungene ¹⁶ transtracheal drypping har blitt mye brukt for å oppnå dette.; imidlertid, som med alle kirurgiske inngrep, bærer også med seg muligheten for komplikasjoner forårsaket av fremgangsmåten i seg selv, og ikke nødvendigvis det middel som skal innpodet. ¹³ Av …

Materials

Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps	N/A	N/A
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2ml Pipettor and Filter Tips	N/A	N/A
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board	N/A	N/A	See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen	N/A	N/A
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment	N/A	http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101