Abstract
このプロトコルは、慢性的に機器の豚とモーター駆動トレッドミル上ブタを行使するための手順への外科的手順を説明します。心肺機能がしばしば麻酔を必要とする、侵襲的に測定される初期の心肺機能障害は、特に、動物モデルにおいて、診断することは困難です。多くの麻酔薬がcardiodepressiveているように、心血管機能の微妙な変化をマスクすることができます。測定は麻酔および急性の外科的外傷の影響を与えることなく、静かな休息の条件の下で得られるように対照的に、慢性計測は、覚醒状態で心肺機能の測定を可能にします。動物が適切に訓練されている場合また、測定は、段階的なトレッドミル運動中に得ることができます。
フロープローブは、心拍出量を測定するための大動脈または肺動脈の周りおよびコロンの測定のための左冠動脈前下行枝の周りに配置されています進血流。液体で満たされたカテーテルは、圧力測定および血液サンプリングのための大動脈、肺動脈、左心房、左心室と右心室に移植されています。また、20 Gカテーテルは、冠状静脈血サンプリングを可能にするために前室間静脈内に配置されます。
回復週間後、3分続く各段階で、5段階の進行性運動プロトコルに豚は、カテーテルは、圧力と流量計に接続され、電動トレッドミル上に配置され、およびブタが施されます。血行動態信号が連続的に記録され、血液サンプルを各運動段階の最後の30秒の間に採取されています。
慢性的にインストルメント動物を研究の主な利点は、安静時だけでなく、運動などの物理的ストレスの間だけでなく、心肺機能のシリアル評価を可能にすることです。また、心肺機能は、病気の発症のA中に繰り返し評価することができますND慢性処置の間、それによって統計的検出力を増加させ、したがって、研究のために必要な動物の数を制限します。
Introduction
適切な心肺機能は特に、このような運動の1時などに増加した代謝要求の状態の間に、酸素や栄養素を体を供給することが不可欠です。運動に心肺応答は心機能、 すなわちにおける適応の数によって特徴付けられる。、行使筋肉を供給する血管床における心拍数、収縮性およびストローク量、および微小血管の機能、 すなわち、血管拡張の増加を同様に肺のように血管系、および胃腸系を供給する血管床だけでなく、非アクティブな筋肉1で血管収縮。障害者運動能力は、心肺機能障害の早期特徴であり、かつ心肺運動負荷試験が損なわ運動能力2を有する患者における心機能不全、血管機能不全および/ または肺機能不全の間に線引きする効果的な方法として使用されています。初期の心肺機能不全をd心肺機能のように、特に、動物モデルにおいて、診断するifficultはしばしばcardiodepressive特性3を有する多くの麻酔薬で麻酔を必要とする、侵襲的に測定されます。
慢性機器は覚醒状態の心肺機能の測定を可能にし、動物が完全に実験室条件の測定値に調整されるときに、麻酔および急性の外科的外傷の影響を与えることなく静かな静止条件下で得ることができます。動物が適切に訓練されている場合また、測定は、段階的なトレッドミル運動4,5の間に得 ることができます。より具体的には、左と、冠状動脈全身および肺微小循環における血管運動緊張の調節を決定することができ、一方、右心室の機能は、評価され、心筋灌流に関連することができます。液体で満たされたカテーテルの使用は、広告を与えることなく、血液サンプルを取るだけでなく、圧力の測定を可能にします動物ditionalストレス。慢性計装動物を研究の別の利点は、それによって統計的検出力を増加させ、したがって、研究のために必要な動物の数を制限し、心肺運動負荷試験は、疾患の発症中または長期治療中のいずれかの、それ自身の対照として、動物の使用を可能に繰り返すことができることです。
豚の心肺解剖学的構造は、密接に人間のこと似ており、糖尿病6、心筋梗塞7、肺高血圧8,9及びペーシング誘発性心不全10,11などの心肺疾患の様々な形態を誘導することが可能です。また、豚の大きさだけでなく、血液ガスを分析するだけでなく、神経液性測定を実行するために、および/または疾患のバイオマーカーを探索するために、慢性計装、および十分な量の繰り返し採血を可能にします。
このプロトコルは、慢性に使用され手術を説明LY機器豚だけでなく、モーター駆動トレッドミルで豚を行使するためのプロトコル。
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Protocol
動物を対象とする手順は、エラスムス医療センターロッテルダム（オランダ）での動物実験委員会によって承認されています。 6と80キロの間の重みを持つ豚が正常にこのプロトコルを使用してインストルメントされています。
人間の取り扱いに動物の1適応
- 施設に到着した後、独りで家動物が、互いに相互作用することを可能に。
- 少なくとも1日1回1週間のために動物を扱うことにより、実験室に動物施設からのヒトの取り扱いおよび輸送に豚をAccustomize。
- 手術前に3回の最低トレッドミル上でそれらを行使することにより、モータ駆動のトレッドミルでの運動実験のために適切に動物を訓練します。
- 動物は、吐き気、嘔吐および胃液のことにより、潜在的な吸引を防止するために、O / N手術前に絶食する必要があります。
外科2.準備
- 鎮静状態
- 10ミリリットルの注射器内鎮静のための薬を準備します。前投薬はチレタミン/ゾラゼパム（5ミリグラム/キログラム）で構成され、キシラジン、（2.25ミリグラム/ kg）及びアトロピン（1 mg）を。
- 豚を鎮静する19 G 1.5 ''針と僧帽筋に筋肉内に薬剤を注入します。
- 約10分間待ち、筋弛緩および鎮静の適切かつ安定したレベルを確認するために無意識を確認してください。
- 麻酔および/または流体のその後の静脈内投与のための耳静脈に20 G周辺の安全カテーテルを配置します。
- 挿管と換気
- 仰臥位でのテーブルおよび/またはトロリーに動物を置きます。
- 経口スプレッダーで動物の口を開きます。
- 顎または挿管を妨げる反射を、嚥下の存在の不十分な緩和の場合には、耳静脈カテーテルを介して静脈内チオペンタール（10mg / kgの）を管理。また、豚はマスクすることができましたイソフルランで鎮静を誘導します。
- laryngoscopistが直接喉頭を見ることができるように光とミラーの刃で従来の喉頭鏡を使用してください。喉頭痙攣がある場合は、けいれんを軽減し、挿管を可能にするためのコードや喉頭に2％リドカインを適用します。
- チューブは上気道の解剖学的構造に優れた適合させると気管に口を通って、声帯の間にチューブを渡すために気管内チューブに挿管スタイレットを挿入します。
- 呼吸ガスの漏れを防止するために、および胃液の可能性誤嚥から気道を保護するために、所定の位置に固定するのに役立つ10ミリリットルの注射器を用いてバルーンカフを膨らませます。
- 呼吸フィルタ（熱と湿気交換器）にし、人工呼吸器にチューブを接続します。
- 手術台上で、右側に動物を置きます。
- 、100-120 mmHgでののpO2レベルを達成する酸素の混合物で動物を換気し、窒素（1：2 v / v）で、usinグラム以下の人工呼吸器の設定：圧力制御モード：呼気終末陽圧（PEEP）4 CMH 2 O;最大吸気圧16から18 CMH 2 O;このカプノグラフィで換気をモニター、約10ミリリットル/ kgで一回換気量をもたらすはずである（20キログラムの動物について、増加体重頻度を減少させる）、動物の大きさに応じた周波数の呼吸。
- 直腸温度計を使用して温度を監視し、37との間の温度に維持 - ヒートランプまたは熱マットを使用して、39ºCを。また、心電図と心拍数を監視します。
- 麻酔
- 誘導及び耳静脈カテーテルを介して（v / v）の換気ガス混合物に又は代替的にフェンタニルの静脈内投与（10μgの/ kg /時）でイソフルランの2.0％を添加することによって、好ましくは、麻酔を維持します。
- 手術を開始する前に、後ろ足のつま先のピンチで痛みの反射神経をテストすることによって麻酔の十分な深さを確認してください。必要な場合、追加追加の麻酔または数分待ちます。手術を通じて定期的に痛みの反射神経をチェックしてください。
- 流体および抗生物質
- 静脈内耳静脈カテーテルを介してアモキシシリン（25ミリグラム/キログラム）の最初の用量を投与。
- 手術中に10％グルコース（500ミリリットル）のゆっくりとした注入を可能にするために耳静脈カテーテルに輸血システムを接続します。
- 手術部位の滅菌
- 左腋窩のすべての方法脊柱から約25センチ幅の領域にわたって動物の皮膚を剃るし、清掃してください。
- 約5分間ポビドンヨードスクラブ（75 mg / mlで）で潤い肌をスクラブ。
- ポビドンヨードローション（100 mg / mlで）で皮膚を殺菌する前に、濡れた滅菌ガーゼで皮膚からポビドンヨード石鹸を削除します。
- 手術部位の細菌の転送と、その後の汚染を低減するために、滅菌外科用ドレープで動物をカバーしています。
3.手術
- オープニング胸部（開胸）
- ダウン左腋窩に肩甲骨の左下角に1cmの尾側（ 図1）を開始し、皮膚に切開を行います。過度の出血を防ぐために、皮膚の血管を焼灼するジアテルミーを使用してください。
- ジアテルミーの切断様式を使用して、鋸筋と大胸筋を通ってカットします。また、過度の出血を防止するために、筋肉層の血管を焼灼するジアテルミーを使用しています。
- 慎重に蚊クランプで左から4番目の肋間の肋間筋を分割する鈍的切開を使用してください。今、内臓と壁側胸膜に覆わ左肺の肋表面が露出されるべきです。
- 胸膜腔を入力するには、慎重に胸膜の両方の層を貫通し、それらを開いた涙。
- 傷のエッジと肋骨を分離するために胸部開創器を使用して、強制的に組織を駆動するために離れて胸膜腔の良好な露出を得ることができます。
- 尾側方向に左肺を離れて押して、濡れたガーゼで場所に保管してください。今、心臓や大血管を明確にさらされるべきです。
- カテーテルとフロープローブの配置（ 図1）
- 下行胸部大動脈の周囲の結合組織の〜2cm角を削除するには、鈍的切開を使用してください。
- 非吸収性USP3-0編組絹縫合糸（Ø0.2mm）ので大動脈壁に、3ステッチからなる、巾着縫合を行います。
- 巾着縫合糸の真ん中にステンレス鋼16 G針で大動脈血管壁を貫通します。
- 大動脈に（リングまで）液体で満たされたカテーテルの先端を挿入し、しっかりと一緒に巾着縫合糸を引っ張ると、縫合糸の2つの文字列を結びます。
- トン再び、所定の位置にカテーテルを保持するカテーテルの周りに3回のリングの上に縫合糸を巻くとするために、縫合糸の2つの文字列を、すなわち。また、挿入場所から約1cm、頭蓋新しいステッチでカテーテルを固定します。
- 手術中に平均動脈圧を監視するために、コンピュータに接続されているキャリブレーションさ圧力変換器に液体で満たされたカテーテルを接続します。確認するか、正しい換気の設定を調整するために動脈血ガスを得ます。
- 交差したカットと心膜を開きます。無傷の心膜上で実行さ横隔神経を保つために注意してください。
- 肺動脈を特定し、Farabeufリトラクタと尾側方向にわずかにそれを引っ張ります。今、上行大動脈および大動脈弓を露出する必要があります。肺動脈を後退しながら、平均動脈圧を監視します。
- 上行大動脈とMetzenbaumはさみを使用して、肺動脈との間の結合組織の小さなカット（〜1cmに）作る、大きな湾曲して上行大動脈または肺動脈のいずれかを分析することができるように、蚊のクランプは、フロープローブを配置します。
- 容器の周りの流れプローブのゴムバンドを配置します。簡単に、これは、ゴムバンドの一端を通して縫合糸を配置するようにするには、容器の周りにこの縫合糸を配置し、ゴムバンドは、容器を囲むまでそれを引っ張ります。
- ゴムバンドのフロープローブ測定装置を修正しました。コンピュータにフロープローブを接続し、流量プローブの正しい配置を確認するために、コンピュータ上で心臓の出力信号を確認してください。
- 大動脈液体で満たされたカテーテル（ - 3.2.5 3.2.2）について記載したのと同じ方法で肺動脈内の液体で満たされたカテーテルを、右心室、左心室と左心房を置きます。これらの構造に巾着縫合を実行する前に、結合組織を除去する必要はないことに留意されたいです。
- Metzenbaumはさみでカット - （3ミリメートル2）公開し、鉗子で組織を持ち上げると小さなを行うことで、左冠動脈前下行枝の近位部分を分析、慎重に綿棒で離れて動脈から組織をからかいました。下に小さなストレート傾斜した蚊クランプを通過させることにより、冠状動脈の完全な解剖を確認してください。
- 冠状静脈カテーテルに接続されている縫合糸、と前室間冠状静脈にステッチ平行してください。
- 冠状静脈カテーテルの20 G針で冠状静脈を穿刺し、静脈内にカテーテルのカニューレを挿入します。
- 針を外し、すでに実行ステッチ（3.2.14）でカテーテルを固定します。また、初期パンクの場所から約1センチメートル新しいステッチでカテーテルを固定します。
- 冠状動脈を下降以前解剖左前周りの冠血流プローブを配置します。動脈が狭窄であり、ほとんど表示されている場合には、容器のよりよい露出を得るために、血管を緩和するリドカイン10％のスプレーを使用しています。 CONFするコンピュータに冠血流の信号を確認してくださいフロープローブ（ 図2）の正しい配置をIRM。
- トンネリング
- トンネル個々の筋肉の下に左第3肋間空間を介して、大規模な湾曲した蚊のクランプを使用して、リブ上記流量プローブ。
- 肋間筋を貫通して第3の左第五肋間空間のいずれかを介して、トンネルの液体で満たされたカテーテルを。液体で満たされたカテーテルをオフにクランプし、穿孔面積を最小限にし、トンネルの間に液体で満たされたカテーテルの漏洩を防止するために三方活栓を削除します。
- 肋間筋に巾着縫合糸を用いて非吸収性USP2-0編組絹（Ø0.3mm）の持つ流量プローブおよび液体で満たされたカテーテルを修正しました。この縫合糸はまた、再度行っ負の胸腔内圧後の空気漏れを防止するのに役立ちます。
- 皮膚中の3切開脊柱に不吉なと並列約2cm、約3cmでを作ります3センチメートル離れてお互いの長さ。
- ピアース背面の切開部への吻側切開部位から左広背筋の下にトロカール。トンネルこのトロカール内のバックに流れプローブおよび流体カテーテル。
- 液体で満たされたカテーテルに栓を配置し、クランプを取り外します。血栓および気泡を除去1,000 IU / mlのヘパリンと流体で満たされたカテーテルを満たすために、血液を引き出します。冠動脈静脈カテーテルは、5000 IU / mlのヘパリンで埋めなくてはなりません。
- 胸部を閉じます
- 最初の切開に約1.5センチ長さ8センチ尾側と平行な切開を行います。
- 大きな湾曲した蚊クランプを皮下この切開部に第六肋間筋を通して胸膜腔からの排水を導きます。残りの流体を除去し、胸部の閉鎖時に胸腔内の負圧を回復するために吸引装置にドレインを接続します。
- 緩和し、膨らませます吸気終末ホールドと肺。視覚的なモニタリングによる肺の十分な充填を確認してください。
- 一緒に非吸収性USP6編組ポリエステル（Ø0.8mm）の持つ2つの別々の部位での第四肋間の肋骨を引っ張ることにより、胸部を閉じます。
- ランニングステッチと非吸収性USP2-0編組シルクを使用して、実行中皮内縫合で皮膚に鋸筋と大胸筋を閉じます（Ø0.3mm）の
- カテーテルとの間の非吸収性USP2-0編組ポリエステル（Ø0.3mm）のと背側の切開を縫合。まず皮膚から結び目1センチメートルで縫合糸にカテーテルを固定、その後、切開部を閉じるために、皮膚に直接結び目を作ります。流量プローブの場合は、フロープローブワイヤーで縫合糸（ 図1）の切断を防止するために、吸収性USP2-0編組ポリグラクチン（Ø0.3mm）の縫合糸を使用しています。
- の頭蓋側に圧力をかけながら慎重にドレインを削除胸腔内の負圧を維持するために切開。非吸収性USP2-0編組ポリエステル（Ø0.3mm）を使用して、巾着縫合糸で切開を閉じ、ワセリンで傷を封印。
手術の図1.概要左上のパネル：動物の無菌エリア、ブルーラインの間に剃毛し、嘘を滅菌する必要があります。切開部位は、赤色の点線で示されています。左下のパネル：カテーテルとフロープローブの写真：液体で満たされたカテーテル（A）、ゴムバンド（B）、20 G針（C）および冠動脈流プローブ（D）を含む冠状静脈カテーテルなどの大動脈/肺流量プローブ。右上のパネル：カテーテルとフロープローブの配置の概略図。 MAPは、平均動脈圧;うわっの静脈、冠状静脈カテーテル。 LAPは、心房圧を残しました。 LVP左心室圧; RVP、右心室圧; PAP、肺動脈圧; CO、心拍出量。 CBF、冠血流。右下のパネル：。縫合糸に沿って約1cmの距離でステッチや結び目で固定バックを終了するトンネルカテーテルこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 手術からの麻酔とリカバリの終了
- すべての切開部位が閉じているときに、麻酔を停止します。
- 薄筋に（0.015ミリグラム/キログラム）イムブプレノルフィンを投与することにより、鎮痛を提供します。
- 動物が独立して呼吸しているときに換気を停止し、人工呼吸器から気管チューブを外します。動物が十分に呼吸している場合は、定期的に確認してください。
- 創傷液を吸収するために、カテーテルの具象部位の間にガーゼパッドを配置します。
- 外部SEを保護するために、カテーテルのgmentsは、動物に弾性ベストを与え、人工シープスキンの2枚の間にカテーテルをパッケージ化します。
- 気管チューブのバルーンを収縮し、動物が嚥下反射を取り戻したときに抜管。
- フェンタニル徐放性パッチによって長期的な鎮痛を提供（20キロの豚のための12μgの/ hrで、体重に応じて強度を調整）。鎮痛の十分な供給を確保するために（そのような下腹部など）皮膚の薄い部分にパッチを配置します。
- ハウス全体の術後期間のための別途の動物。動物を暖かく保つために手術後の最初の週のための加熱ランプを提供します。
- 動物は独立して飲んでされていない場合、十分な流体IVを供給してください。
- 血栓形成を防止するために - （5000 IU / mlの千）最初のヘパリン添加生理食塩水で最終的に生理食塩水を補充してから、血栓を除去するために血液を引き出すことによって、日常の液体で満たされたカテーテルをフラッシュします。任意の空気bubbを注入しないように注意してくださいレカテーテルのフラッシュ中。
- 手術後の感染を防止するために、手術後6日間アモキシシリン（25ミリグラム/ kg）を静脈毎日を管理します。
- 動物がトレッドミル実験を開始する前に、1週間回復できるようにします。
4.トレッドミル実験（図2）
- （3.5.10）に記載のように液体で満たされたカテーテルをフラッシュし、圧力変換器にフラッシュされたカテーテルを添付します。温度補正された血液ガス値を得ることができるように直腸温度を測定します。
- 気泡による信号の減衰を防ぐために、生理食塩水で圧力変換器をフラッシュします。背側に弾性ベストに圧力変換器を取り付けます。
- アンプに圧力変換器と流量プローブを接続します。コンピュータプログラムで計測を開始し、0 mmHgでは空気に開放されて圧力変換器と流量プローブを校正（および動物に閉じている）と圧力計を用いて100 mmHgで。
- 必要に応じて、混合静脈および動脈血液のサンプリングのための流体のカテーテルのいずれかに延長線を接続します。
- 動物が横たわっているだけでなく、トレッドミル上で静かに立っている時に血行動態を測定します。平均血圧は、10秒の時間枠にわたって測定されています。
- 純粋な血液1mlをヘパリン処理1ml注射器を用いて得ることができるように、最初の10 mlシリンジを用いて、5mlの血液を吸引することによって、動脈および混合静脈血サンプルを得ます。冠状静脈血サンプルについて、2mLの注射器を用いる代わりに、1mlの10 mlシリンジと離脱は、純粋な血液を得るのに十分です。
- 決定するために、血液ガス分析器を用いて血液サンプルを処理する前に、氷上で密封された1ミリリットル注射器を保管してください動物の代謝と換気状態。
- 5キロ/時（最大心拍数の〜85％） - トレッドミル、スピードあたり3分、1に5段の運動プロトコルに豚を施します。静止位置にあるように、各速度に速度あたり2分 - 1.5後の血行動態及び血液ガスを得ます。
- 運動プロトコル後に栓を閉じて、ドリフトが0 mmHgのキャリブレーションで発生しているかどうかを確認し、このキャリブレーションをメモします。液体で満たされたカテーテルの圧力変換器を取り外し、流量プローブを切断します。
- （ - 5000 IU / mlの千）の生理食塩水およびヘパリンと流体で満たされたカテーテルをフラッシュします。人工シープスキンの2枚の間に弾性ベストの下にそれらを置くことによって、カテーテルとフロープローブを保護します。動物は、現在、そのケージに戻すことができます。
図2.トレッドミル実験。左ペインLS：トレッドミル上のインストルメント豚。流体で満たされたカテーテルは、豚の背面に配置された圧力変換器に接続されています。右上のパネル：トレッドミル、アンプと記録コンピュータを含む全実験のセットアップの概要。右下のパネル：記録された血行動態データの典型的な例。上から下へ。大動脈圧（AOP、青）と左心室圧（LVP、赤）。左心房圧（LAP、青）と左心室圧（赤）;肺動脈圧（PAP、青）と右心室圧（RVP、赤）。大動脈流/心拍出量（AOF、青）。冠血流（赤CBF）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Representative Results
5キロ/時のエクササイズまでは、主との組み合わせで毎分137±7 256±8拍から心拍数の増加によって達成された4.3±0.3 0.7±8.5 L /分の心拍出量の倍増をもたらしました32±2±3〜36ミリリットル（ 図3）からのストローク量のわずかな増加。一回拍出量の増加は共に左心室の弛緩速度の増加、左の増加に伴って、左心室圧のdP / dtmaxの一次導関数の最大値の増加によって証明されるように、左心室の収縮性の増加により促進されました心房圧、左心室（ 図3）の充填圧力です。一緒に（9.2±0.4グラム/ dlで8.5±0.4から）ヘモグロビン濃度の増加に伴う心拍出量の増加と、71±1％に45±1からボディ酸素抽出の増加は、TRを許可しました身体の酸素消費量のIPLを実行（ 図3）。それが大動脈圧を意味するので、全身の血管拡張は（ 図3）のみわずかに増加し、全身血管コンダクタンスの増加とほぼ完全に心拍出量の増加を収容する全身血管抵抗の低下によって証明されるように発生しました。運動はまた、肺血管コンダクタンスの33±8％の増加によって証明されるように、肺循環の適度な血管拡張をもたらしました。しかし、一緒に（3±1から10±1 mmHgで）から左心房圧の増加に伴って心拍出量の101±8％の増加は、（肺動脈圧が増加し、それによって右心室後負荷の増加をもたらしました図3）。
動脈圧のわずかな増加とともに、心拍数の増加は、左心室の心筋酸素短所が増加しましたumption、主にヘモグロビン濃度の増加と組み合わせて（738±68マイクロモル/分で310±37）から、心筋酸素供給の増加をもたらし、冠血流の増大によって満たされました。心筋酸素需要の増加は、（最大運動時の81.6残り±1.9％で79.8±1.9％）、心筋酸素抽出として、心筋の酸素供給の増加に見合った本質的に変化し、冠状静脈酸素飽和度と冠動脈の結果、一定に維持しました静脈の酸素圧（ 図3）。
エクササイズ。ボディ酸素消費量（BVO2） に図3.典型的な血行動態応答は、運動強度（パネルALのx軸）の指標としました。心拍数（HR、パネルA）、一回拍出量（SV、パネルB）、最大の応答が示されますIMUMと収縮と弛緩の速度の指標として左心室圧（DP / dtmax、パネルCおよびDP / dtmin、パネルDのRESP）の一次導関数の最小値、心拍出量（CO、パネルE）は、（MAP平均動脈圧パネルF）、全身血管コンダクタンス（SVC、パネルG）は、全身血管抵抗（SVR、パネルH）、肺動脈圧（PAP、パネルJ）は、肺血管コンダクタンス心房圧（LAP、パネルI）の左（PVCパネルK）。総肺抵抗（右心室後負荷のためのTPR指数はパネルL、運動中に増加しました）。一緒に動脈圧のわずかな増加と心拍数の増加は、主に冠状動脈の血流（CBF、パネルM）の増加によって満たされた左心室の心筋酸素消費量（パネルMPのX軸）の増加をもたらし心筋酸素抽出（MEO2、パネルN）として、冠状静脈酸素飽和度（CVSO2、パネルO）および冠状静脈酸素圧（cvPO2、パネルP）の最小影響を受けました。すべてのデータは平均値の標準誤差（SEM）で、平均提示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、豚の慢性計測のための手術だけでなく、血行動態を測定しながらモーター駆動トレッドミル上計装豚を行使し、動脈、混合静脈および冠状静脈血中の酸素含有量の測定のための血液試料を採取するためのプロトコルについて説明します。
プロトコル内の重要なステップ
挿管処置の間にすでに開始プロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。チオペンタール（2.1.5）したがって、投与の際に迅速な挿管を必要とする、呼吸抑うつ薬です。また、慎重に処置中に人工呼吸器の設定を監視することが重要です。胸腔は（ステップ3.1.4）開かれたときにこのように、これは、負の胸腔内圧の損失をもたらします。この損失を補償し、肺胞の崩壊を防ぐために、換気が呼気終末陽圧（PEEP）が必要です。また、人工呼吸器の設定（最大吸気プレスUREは）〜10ミリリットル/キログラムの一回換気量を維持するように調整されるべきです。また、左肺が離れて押された場合（3.1.6。）一回換気量が左肺の一部のみが換気されているため、減少する可能性があることに注意してください。人工呼吸器の設定は、血液ガスに基づいて調整されるべきです。
流体満たされたカテーテルと血行動態測定に関してもう一つ重要な点は、圧力変換器と心臓血管系への流体で満たされたカテーテルの挿入部位との間の静水圧差があるということです。弾性ベスト（4.2）上の圧力変換器の圧力のレベル、およびカテーテルの挿入点の間の高さの差は、手術中及び動物を犠牲に推定及び補間前または後のいずれかの処理によって補正されるべきですデータ。
この技術を使用する際に考慮すべきもう一つの重要な点は、手術中にまたは反復中のいずれかで、その血液の損失であります採血は、豚が比較的大きく、その結果、大血液量（65ミリリットル/キログラム）を有するという事実にもかかわらず、最小化されるべきです。手術中に、カテーテルの挿入中に血液の損失は、単に、穿刺傷に圧縮を適用することによって最小限に抑えることができます。動物実験のガイドラインによると、循環血液量の10％までは、最小限の副作用で、通常、健康な動物からの単一の機会に撮影することができますが、それは血液15のこの量を補充するために約14日間、動物をかかります。これは、血液のかなりの量が失われたときに、手術からの回復が長くなることを意味します。
運動実験中繰り返し採血時に、動物の循環血液量の1.0％、0.6ミリリットル/のkgで最大24時間毎に15を除去することができます。これはまた、トレッドミル運動中にサンプリングされた血液の量は、iniファイルを除去した後、十分に計画し、そのあるべきであることを意味します血液との界面で先端付近のカテーテルのルーメン内に常に存在しているシャルの塊は、ラインをフラッシュするために引き出され、残りの血液が戻って動物に与えられるべきです。
修正およびトラブルシューティング
移植された液体で満たされたカテーテルがあるため、血栓形成の誤動作を防ぐために、毎日フラッシュする必要があります。流体充填カテーテル内の血液凝固の量に応じて、各ラインのヘパリンの量は、5,000 IU / mlの千IU /から変化させることができます。ヘパリンの量は、抗凝固剤ヘパリンの存在による外科的切開の傷からの出血を防ぐために、手術後の最初の週に最小限に抑える必要があります。
しかし、毎日のフラッシュ場合でも、いくつかの液体で満たされたカテーテルが詰まってしまいます。これが発生すると、最小限および/または拍動吸引を適用することにより、より小さな2ミリリットルの注射器で血液を回収してみてください。カテーテルが解除されます前に、それは数分かかることがあります詰まりました。これが動作しない場合には、慎重にカテーテル内に生理食塩水を少量流し、すぐに血液を撤回しようとします。注入はカテーテルの部位に応じて、遠位臓器の循環および塞栓に血栓の放出をもたらすことがあるので注意してください。慎重にフラッシュが動作しない場合には、血行力学的信号がまだあるかどうかを確認するために圧力変換器に詰まったラインを接続してください。信号がない場合は、流体充填されたラインは、いくつかの結び目によって密封され、遮断されるべきです。
解釈と制限事項
上記のように全ての点を考慮すると、血行動態測定及び血液サンプルの組み合わせは、単独で、トレッドミルの速度7,12よりも運動強度のためのより良い尺度である全身および心筋酸素消費量の点で運動応答の解釈を可能にします-14。
体の増大した代謝要求を満たすために、EXERciseは、心臓機能の変化だけでなく、地元の灌流の変更が必要です。組織灌流は、組織を供給する血管床の小動脈及び細動脈の直径の変化によって調節されます。神経液システム、内皮および地元の代謝物から誘導された無数の血管作動性因子は、血管緊張を決定し、適切な組織灌流1,5,12,16を確保するために相互作用します。全身および肺血管抵抗や逆、血管コンダクタンスの変化は、血圧および流量信号から計算され、全身および肺の血管系における血管運動緊張の変化の観点で解釈することができます。直感的に、血管抵抗は、多くの場合、血管緊張の変化を評価するために使用されます。コンダクタンスと抵抗がコンダクタンスは圧力、流量で割った抵抗に等しい圧力のための正規化された流れであることで、数学的に関連しているものの、私たちの研究グループでは、我々はコンダクタンスの使用を提唱しています。コンダクタンスおよび解像度が、istanceは1つが、単一の刺激（ すなわち、運動）7,17の効果を調査する場合は、薬理学的介入と運動を組み合わせたときに、二つのパラメータの解釈は血管緊張4の制御に様々な血管作動性システムの寄与を調べるために、異なる可能性が交換可能であり、 、5,7,14,18。
運動中、全身循環は低流量と高流量、低抵抗、（高コンダクタンス）を持つシステムに高抵抗（ すなわち、低コンダクタンス）によって特徴付けられる安静時のシステムから変換します。このように、薬理学的血管拡張は、運動に対する安静時のコンダクタンスと抵抗のために異なる結果をもたらします。コンダクタンスの増加はわずかであるが安静時の、薬理学的血管拡張によって生成される抵抗の低下が大きくなります。これとは対照的に、運動時の血管拡張のと同じ程度はOコンダクタンスの大幅な増加につながりますが、抵抗のわずかな減少をNLY。コンダクタンスを用いた場合、抵抗血管拡張を見たときに静止して大きくなるように表示されつつ、より大きな血管拡張は、運動中に発生すると思われます。抵抗やコンダクタンスを使用した場合のデータの解釈は、このように異なっています。抵抗とコンダクタンスとの間の選択ではなく、任意のように見えるかもしれませんが、物理学の主要な変化を受ける変数は、応答7,17,18のための指標の分子として指定されています。時の大動脈血圧が著しく心拍出量が増加する一方で、かなり一定のまま行使するので、行使する全身血管応答を記述するために最も適切なパラメータではなく抵抗よりも全身血管コンダクタンス（心拍出量/大動脈血圧）、であるように思われます。また、全身の循環は、主に並列的に灌流された器官の様々な血管床の多数で構成されています。並列抵抗はレシプロを追加しますので、平行導体が直線的に足しながら的には、特定の地域の血管床のコンダクタンスの変化は、総全身血管コンダクタンスの同一の（絶対的な）変化に変換されます。この考慮事項は、行使する全身血管応答を記述するための血管コンダクタンスの使用にさらなる支持および薬理学的介入を貸します。
肺のベッドで行使する血管の応答を記述するための抵抗またはコンダクタンスのいずれかの選択は運動は心拍出量の増加だけでなく、肺動脈圧7,17を製造しているため、あまり目立たないように思われます。抵抗またはコンダクタンスのいずれかの選択は、によって生成される血管拡張の程度と比較して、PVRとPVCの比較的小さな運動誘発性の変化を考慮して、また、例えば、ET-受容体遮断7それほど重要ではありません。結果として、抵抗またはコンダクタンスのいずれかの使用は、O、血管作用を特徴づけるために肺循環におけるFAの薬理学的血管拡張剤は、同様の結論が得られます。
冠循環では、データの解釈はさらに複雑にするだけでなく、冠状動脈抵抗血管のトーンの変化における内因性血管作動性物質の結果の薬理学的ア ンタゴニストの全身投与などであるが、多くの場合も、全身の血行動態変数7,14,17の顕著な変化をもたらします19。これらの変更された血行動態は、心臓の仕事に影響を与え、それによってむしろ冠血管のトーン上の介入の直接の効果としてよりも、心臓の代謝要求または自己調節の変化から生じる冠状動脈の血流の変化を引き起こします。例えば、内因性血管収縮剤システムの遮断は、全身の血管拡張の結果として、平均大動脈圧を減少させ、冠動脈微小血管緊張の自己調節の調整を誘発します。また、圧受容器反射の活性化は、心拍数aを増加させるように作用しますND心筋収縮。心拍数及び/又は血圧のような変化は、続いて、心筋酸素供給の調整を必要とし、従って冠血流量で、心筋の代謝の変化をもたらします。
このアプローチは、冠状動脈抵抗血管緊張の調節の評価を可能にするように考慮心筋酸素消費量のような薬剤誘発性の変化の影響を取るために、研究者らは、冠状静脈酸素濃度と心筋酸素消費量（MVO 2）4,5との間の関係を調べます独立して心筋の酸素需要の変化の。血管拡張剤の投与は、MVO 2の与えられたレベルで心筋の酸素供給を増加します。酸素供給の増加は酸素消費量の変化なしに起こるように、心筋酸素抽出により冠状静脈の酸素含有量、従ってMVO 2との間の関係の上方シフトの増加につながる、減少します4,5を研究するために、心筋の酸素要求量、ならびに心筋の酸素供給の両方を測定することが肝要です。
その優雅さと有用性にもかかわらず、一部の研究者は、このアプローチ20の限界を指摘しています。このように、冠状静脈PO 2または冠状静脈SO 2対MVO 2をプロットし 、これらの変数は、実際にMVO 2計算する式の一部であるため、不適切であると考えることができました。その結果、MVO 2は、冠状静脈PO 2またはSO 2とは独立した変数ではありません。また、研究者らは、心筋の仕事の別の索引を使用して検討する必要があり、心拍数および左心室収縮期圧の積である速度圧力積（RPP）、。しかし、RPPとMVO 2はほぼ直線的に関係しているように、SMVO 2のためのRPPをubstitutingすることは実質的に同一の結果14が得られ 、かつMVO 2と冠状静脈酸素濃度との関係は、冠動脈血管運動トーンの変化を研究する敏感な方法であると考えられます。
既存の方法に関して意義
一般的に、血管緊張の調節における変化を評価するために使用される別の方法は、圧力またはワイヤミオグラフ6,14,21で孤立冠状動脈と肺小動脈や細動脈の使用です。ミオグラフ研究の利点は、血管が周辺組織に依存せず、潜在的に循環要因から影響を交絡せずに研究することができるということです。これらのインビトロ技術は、従って、インビボでの測定値と相補的です。しかし、in vivoおよびin vitro技術では時々反対の結果を与えます。例えば、強力な血管収縮物質エンドセリンに対する応答がそのまま冠動脈circulatioに減少しました nは心筋梗塞後の、健康な対照豚に比べて心筋梗塞に豚から分離された冠状動脈小動脈に拡張されました。21 in vivoでの間および in vitroのデータのこの差は、プロスタノイドによってエンドセリンの血管収縮の影響の増加抑制によるものでした生体内 21インチ
将来の応用
左右両方の心室機能不全における冠動脈微小血管機能の変化の提案された役割を考えると、心臓血管疾患の関連モデルにおけるこれらの変化の評価が必要です。慢性的にインストルメント動物の使用は、微小血管（DYS）関数で疾患の重症度の相関を可能にします。微小血管機能不全は、運動時のように、心血管ストレス下に明らかにすることができる一方でまた、両方の冠状動脈と肺微小血管機能は、基礎静止条件下で正常に見えることがあります。
慢性的にインストルメントアニマの結論として、使用lsコマンドは、それによって、統計的検出力を高め、研究のために必要な動物の数を制限し、いずれかの疾患または治療の評価の開発中に心肺機能のシリアル評価を可能にします。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、（DJドゥンカーへ）オランダ心臓財団の助成金2000T038によってサポートされていました（D. Merkusに）2000T042を付与し、欧州委員会FP7-健康-2010グラントMEDIA-261409（DJドゥンカーとD. Merkusへ）、オランダ心臓血管研究イニシアティブ：オランダ心臓財団、大学医療センターのためのオランダ連合、健康研究開発と科学のオランダ王立アカデミーのためのオランダ機構 CVON- ARENA CVON 2011-11、（D. Merkusへ）CVON-ファイドラCVON2012-08とCVON-RECONNECT CVON 2014から11（DJドゥンカーへ）、ソフィア財団（DJドゥンカーとD. Merkusへ）（D.デへウィイス-Meijler、D. MerkusとIKMライス）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcocks | B. Braun | 16496 | |
| Perfusor lines PVC (DEHP-free) 150 cm/2.6 ml | B. Braun | 8722960 | Used for fluid filled catheters |
| “python “ silicontubing | Rubber BV | 1757 ID 1 mm, OD 2 mm | Used for fluid filled catheters |
| Sodium Chloride 0.9% | Baxter | TKF7124 | |
| Glucose 10% | Baxter | WE0163 | |
| Suction device | |||
| Slim-Line electrosurgical pencil with 2 buttons | ERBE ELEKTROMEDIZIN GMBH | 20190-066 | |
| Servo Ventilator SV900C | Siemens-Elema AB | ||
| Laryngoscoop | Vererinary Technics Int. | 11.02.47 | |
| Sterile surgical gloves | |||
| tie-on surgical mask | 3M | 1818FS | |
| surgical hat | Klinidrape | 621301 | |
| Procedure pack | Molnlycke Health Care | 97027809 | Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc |
| Droptears | Alcon | 288-28282-01 | |
| Betadine scrub 75 mg/ml Povidone-iodine | Meda Pharma BV | RVG08939 | |
| Betadine solution 100 mg/ml Povidone-iodine | Meda Pharma BV | RVG01331 | |
| Cuffed Endotracheal tube | Emdamed | size depends on animal size | |
| Breathing filter Hyrdo therm 3HME | Intersurgical | 1560000 | |
| Laryngoscope Handle+ Miller blade size 4 | Kawe Germany | ||
| Manual resuscitator- Combibag | Weinmann | 6515-12-313-5596 | |
| Perivascular flow probe 3PS | Transonic | For coronary artery; Size 2.5 - 4 mm depending on animal size | |
| Confidence flow probe | Transonic | For aorta/pulmonary artery, 16 - 20 mm; size depends on animal size | |
| Venflon-Venisystem 20 G x 32 mm | BD | 393224 | For coronary venous catheter |
| Blunt Needle 18 G | For coronary venous catheter | ||
| Tygon Tubing | Rubber BV | 2802 ID 0.8 mm (1/32’’), OD 2.4 mm (3/32’’) | For coronary venous catheter |
| Suction Handle 17 cm 6 6/8 " Coupland 18/8 martinit with tube connector | KLS Martin Group | 18-575-24 | |
| Scalple blade | |||
| Scalpel Handle 13.5 cm 5 3/8 " Stainless Steel solid | KLS Martin Group | 10-100-04 | |
| Vascular Forceps 20.2 cm 8 " De Bakey Stainless Stee | KLS Martin Group | 24-388-20 | ± 14 cm |
| Dressing Forceps 17 cm 6 6/8 " Cushing Stainless Steel | KLS Martin Group | 12-189-17 | ± 18 cm |
| halsted-musquito straight 12.5 cm - 5" | Rudolf Medical | RU-3100-13 | ± 12 cm |
| halsted-musquito curved 12.5 cm - 5" | Rudolf Medical | RU-3101-12 | ± 12 cm |
| Dissecting and Ligature Forceps 13 cm 5 1/8 " Gemini Stainless Steel | KLS Martin Group | 13-451-13 | ± 12 cm |
| Dissecting and Ligature Forceps 18.5 cm 7 2/8 " Schnidt Stainless Steel | KLS Martin Group | 13-363-18 | |
| Rib Retractor Finochietto, Baby Aluminium - | KLS Martin Group | 24-162-01 | |
| suture forceps Mayo-Hegar 3 mm 18 cm - 7" | Rudolf Medical | RU-6050-18 | |
| Metchenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)" | Rudolf Medical | RU-1311-14M | |
| Retrector farabeuf 12 cm - 4 (3/4)" | Rudolf Medical | RU-4497-12 | |
| Towel forceps schrädel curved 9cm - 3,5" | Rudolf Medical | RU-3550-09 | |
| surgical scissors blunt 13 cm - 5" | Rudolf Medical | RU-1001-13 | |
| Gauzes Cutisoft 10 x 10 cm 4-ply | BSN Medical | 45846-00 | |
| Gauzes Cutisoft 5 x 5 cm 4-ply | BSN Medical | 45844-00 | |
| Flowmeter -CM2 / SF2 - 2gas (O2 and Air) | UNO BV | 180000008 | |
| Tec 7 Vaporizer | Datex-Ohmeda | ||
| Acederm wound spay | Ecuphar NV | ||
| Vaseline Album | Bufa | 165313 | |
| silkam 3-0 Natural silk, non-absorbable | B. Braun | F 1134043 | sutures for placement of catheters |
| silkam 2-0 Natural silk, non-absorbable | B. Braun | F 1134051 | sutures for muscular approximation |
| dagrofil 3-0 Polyester, non-absorbable | B. Braun | C 0842478 | sutures for fluid fille catheters after tunneling |
| Vicryl rapide 3-0, 1 x 45 cm FS2, V2930G | Daxtrio medische producten | 15560 | sutures for electrical catheters after tunneling |
| Vitafil 6 USP | SMI | 6080 | Ties |
| Syringes | 10 ml and 2.5 ml | ||
| Heparin LEO (heparin sodium) | LEO Pharma A/S | ||
| Zoletil | Virbac | tiletamine / zolazepam | |
| Sedazine | AST farma | 108855 | xylazine |
| Temgesic | RB Pharmaceuticals | 5429 | buprenorphine |
| Tensogrip | BSN Medical | 71522-00 | elastic vest |
References
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