Myéloïde cellule d'isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em> Plasmodium</em> sporozoïtes
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
L' infection du paludisme commence lorsque le stade sporozoïte de Plasmodium est inoculé dans la peau d'un hôte mammifère par une piqûre de moustique. Le parasite très mobiles non seulement atteint le foie pour envahir les hépatocytes et de transformer en une forme globulaire-infectieux. Il migre aussi dans la peau et les ganglions lymphatiques drainant le site proximal par injection, où il peut être reconnu et dégradé par des résidents et / ou des cellules myéloïdes recrutés. Imagerie intravitale a rapporté le recrutement précoce de leucocytes positifs fluorescent brillamment Lys-GFP dans la peau et les interactions entre les sporozoïtes et CD11c + cellules du ganglion lymphatique de drainage. Nous présentons ici une procédure efficace pour récupérer, identifier et dénombrer les sous-ensembles de cellules myéloïdes qui sont recrutés sur la peau de souris et de drainage des ganglions lymphatiques après l'injection intradermique de immunisant doses de sporozoïtes dans un modèle murin. La caractérisation phénotypique utilisant flux multi-paramétrique fournit cytométrieun test fiable pour évaluer les changements cellulaires dynamiques précoces en réponse inflammatoire à l' infection par Plasmodium.
Introduction
Le paludisme est l'une des maladies infectieuses les plus meurtrières dans le monde, tuant plus d'un demi-million de personnes par an. L' infection par Plasmodium, l'agent causal de la maladie, débute par une phase de pré-érythrocytaire (PE). Au cours de cette phase, les sporozoïtes injectés dans la peau de l' hôte par un moustique anophèle femelle atteignent le foie via la circulation sanguine et de se différencier hépatocytes à l' intérieur dans les formes parasitaires qui infectent les globules rouges et causent les symptômes de la maladie.
Les étapes de PE de Plasmodium représentent une cible privilégiée pour la vaccination anti-malaria. En effet, les vaccins vivants atténués contre ces étapes, comme le rayonnement atténué sporozoïtes (RAS), les parasites génétiquement arrêtés (BPA) ou chimioprophylaxie et sporozoïtes (CPS) ont démontré leur capacité à protéger à la fois les rongeurs et les hôtes humains 1-9. Dans le modèle de rongeur, la plupart des études de vaccination sont effectuées en utilisant une immunisation par voie intraveineuse, Qui est l'étalon-or en termes d'efficacité de protection. Cependant, la description d'un étage de la peau et l'importance du ganglion peau associée drainage (DLN) pour induire une protection a changé notre perception de la phase de PE et a souligné l'importance de l'injection par voie intradermique. Imagerie intravitale de P. berghei sporozoïtes injectés dans la peau de rongeurs ont montré que seulement environ 25% de l'inoculum atteint le foie via la circulation sanguine. Le reste ~ 75% distribue entre la dLn proximale (~ 15%) et la peau (~ 50%) 10,11, où une petite proportion peut transformer et rester en vie pendant des semaines à l' intérieur des cellules de la peau 12,13. En outre, des études ultérieures ont décrit que la mise en place d' une immunité protectrice efficace après la vaccination intradermique se déroule principalement dans la peau-DLN, où les cellules T CD8 + spécifiques du parasite sont activés, et que de façon marginale dans la rate ou du foie-DLNS 14,15.
Tandis quela plupart des études se sont concentrées sur la caractérisation des cellules effectrices impliquées dans la mise en place de la réponse immunitaire protectrice, on sait beaucoup moins sur le sort des parasites vivants atténués injectés dans la peau, en particulier leurs interactions avec le système immunitaire inné. En particulier, la caractérisation des cellules présentant des antigènes impliqués dans l' antigène du parasite absorption, le traitement et la présentation aux cellules T CD8 + est d' une importance cruciale, sachant que l' acquisition de l' antigène PE peut se produire aussi bien dans la peau et les compartiments DLN. Des études antérieures d'imagerie intravitale décrit un afflux précoce de cellules positives fluorescentes vives Lys-GFP dans la peau suite à une piqûre de moustique infectieux 16 tout début des interactions entre les sporozoïtes et les cellules dendritiques ont été observées dans le dLn 10,17. Plus récemment, il a été rapporté que les sporozoïtes inoculés dans la peau par les moustiques augmente la motilité des deux lymphocytes T de régulation et dendritiques dans la peausouris, tandis qu'un certain nombre de diminution des cellules présentatrices d'antigène a été observée dans le dLn 18.
Nous avons cherché à identifier et quantifier plus précisément les sous – ensembles de leucocytes recrutés dans la peau et dLn correspondants, ainsi que ceux qui interagissent avec le parasite après l' injection intradermique de doses immunisantes de RAS 19. Dans ce contexte, nous avons isolé les cellules myéloïdes (CD45 + CD11b +) des deux tissus et caractérisé par des sous – populations d'intérêt flux paramétrique multiples = cytométrie. Conformément à la réponse immunitaire décrite dans le stade précoce de Leishmania major infection de la peau 20, la réponse de l' hôte principal de sporozoïtes injection se compose d'un recrutement successif de polynucléaires neutrophiles (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) , suivie par les monocytes inflammatoires (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) qui sont identifiés sur la base de differentil'expression al des marqueurs de surface et Ly6G Ly6C.
Nous décrivons ici un protocole pour isoler les cellules myéloïdes de la peau de la souris et dLn après injection intradermique de doses immunisantes de RAS extraits de glandes infectées salivaires du moustique. injections intradermiques reproductibles et le traitement des tissus sont des étapes importantes pour quantifier les changements phénotypiques de l'infiltration population de cellules dans les tissus infectés. L'approche détaillée ci – dessous fournit un test fiable pour évaluer la peau et la réponse inflammatoire dLn à Plasmodium parasite et peut être étendu à divers systèmes expérimentaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans la perspective de la vaccination à grande échelle de l' homme à l' aide d' un vaccin sporozoïtes du paludisme ensemble, l' un des principaux défis à relever est de développer des voies et des méthodes d'administration des parasites optimisés pour assurer la vaccination et la protection 24,25 réussie. Chez les humains, l'évaluation de l' efficacité protectrice médiée par des parasites vivants atténués (LAP) a été réalisé en suivant les moustiques naturel mor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Patricia Baldacci, Vanessa Lagal et Sabine Thiberge pour la lecture critique, Irina Dobrescu et Sabine Thiberge pour les aider à prendre des photos et Pauline Formaglio pour l' enseignement dans l' imagerie in vivo de sporozoïtes motilité dans la peau de la souris. Nous tenons également à remercier Marek Szatanik et le Centre de production et infection des anophèles (CEPIA-Institut Pasteur) pour les moustiques élevage. Cette étude a été soutenue par le Fonds AXA pour la Recherche et les fonds du Laboratoire d'excellence "biologie intégrative des maladies infectieuses émergentes" (subvention no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
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