Визуализация подергивания моторики и характеристика о роли<em> PilG</em> в<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
В этом исследовании, камера поток нано-Микрожидкостных был использован для визуализации и функционально характеризуют подергивания моторику Xylella fastidiosa, бактерии , которая вызывает болезнь Пирса в виноградной лозы.
Abstract
Xylella fastidiosa является грамотрицательная , не жгутиковых бактерия , которая вызывает ряд экономически важных заболеваний растений. Подергивания моторика обеспечивает X. fastidiosa средство для передвижения на дальние расстояния внутри растений и колонизации, способствуя к патогенности в X. fastidiosa. подергивание моторика X. fastidiosa работает по типу IV ворсинок. Тип IV Пили из Xylella fastidiosa регулируются pilG, регулятор хемотаксиса в Пиль-CHP белков , кодирующих оперон, которые участвуют в пути передачи сигналов. Для выяснения роли pilG в подергивания моторики X. Были разработаны fastidiosa, А pilG дефицитных мутант Xf ΔpilG и комплементарной штамм XfΔpilG- С , содержащей нативный pilG. Микрожидком камеры интегрированы с системой записи изображения в заданный промежуток времени был использован для наблюдения подергивания моторику в XfΔpIlg, XfΔpilG- C и его штамм дикого типа. С помощью этой системы записи, она позволяет долгосрочные временные и пространственные наблюдения агрегации, миграцию отдельных клеток и популяций бактерий через подергивания моторики. X. fastidiosa дикого типа и дополняют друг друга штамм XfΔpilG- C показали типичные характеристики подергивания моторики непосредственно наблюдаемые в микрофлюидальных проточных камерах, тогда как мутант XfΔpliG выставлены подергивание дефицитный фенотип. Это исследование показывает , что pilG способствует подергивание моторики X. fastidiosa. Камера Микрожидкостных потока используется в качестве средства для наблюдения подергивания перистальтику.
Introduction
Xylella fastidiosa является грамотрицательная не-жгутиковых, патогенный микроорганизм , который вызывает ряд экономически важных заболеваний сельскохозяйственных культур, в том числе болезни Пирса в виноградной лозы (Vitis винифера L.) 1,2, 3. Эта бактерия ограничена водопроводящие ксилемы судов. Заражение виноградной лозы вызывает закупорку сосудов ксилемы и приводит к водному стрессу и дефициту питательных веществ 3. Успешная колонизация зависит от способности бактерий , чтобы перейти от исходного места инфекции к остальной части растения 3. Подергивание моторику является средством жгутиков-независимого бактериального движения через расширение, привязанность и втягивании IV пилей полярный типа 4 , который был охарактеризован в X. fastidiosa 5,6,7.
Подергивания моторики наблюдается лазерным пинцетом и атомно – силовой микроскопии (AFM) 8,9,10. Используя эти методы, тКолдовская генерируется данные подвижности типа IV пилуса из N. гонореи и P. палочки характеризовались фл uorescently маркировки ворсинок и захвата их движения микроскопически. Хотя оба метода подробно сила адгезии отдельных бактерий, процедуры являются сложными и отнимает много времени 9,10. Микроэлементы uidic камеры FL использовались для наблюдения на дальние расстояния миграции отдельных клеток, а также небольшие агрегаты бактериальных клеток 5,6. Эти камеры были разработаны как микроизготовленном-нано-канал в пластине , интегрированной с покадровой системы записи изображения 11,12,13,14. Микро ф-л uidic устройства камеры имеют ряд преимуществ для изучения поведения движения и межклеточные взаимодействия бактерий: (I) она обеспечивает интегрированную платформу с несколькими возможностями канала; (Б) он может изучить движения и скопления одиночных клеток в наноразмерных особенностей бактерий; (III) она позволяет прямую мicroscopic записи изображения бактериальных клеток и анализа покадровой, (IV) она обеспечивает долгосрочные временные и пространственные наблюдения отдельных и / или популяций бактерий в микро-среде; (V) скорость потока культуральной среды в канале можно точно контролировать и (VI), только очень небольшой объем (1 мл) культуральной среды требуется для каждого эксперимента.
В последнее время , микро фл uidic потока система была использована для исследования поведения бактериальных клеток при различных микросреды 14,15,16. Адгезивность и прикрепление поверхность Е. палочка 15, X. fastidiosa 16 и Acidovorax citrulli 14 стеклянных поверхностей были оценены с использованием микро Fl uidic камеры. Формирование агрегации и био пленка опосредовано типа IV фимбрий из Acidovorax citrulli были проанализированы 14. Кроме того, движение А. citrulli наблюдается при потока сonditions показали , что тип IV фимбрии могут играть важную роль в колонизации и распространению А. citrulli в сосудах ксилемы при соке потока условиях. Подергивание синегнойной данные подвижности палочки и X. fastidiosa клетки успешно наблюдали против жидкости тока в камере 5,6,17 микроизготовленном потока. Тип IV пилуса дефицитный pilB и pilQ мутанты X. fastidiosa были найдены глубоко изменить скорость подергивание моторику при условиях потока в микро – фл uidic устройств 5,6,18. Исследования , проведенные на бактериальную адгезию и моторики в микро- фл uidic устройств показали , что микро – эт uidic камеры, особенно пригодны для анализа подергивание моторику и миграцию фимбрии-опосредованной бактерий в пробирке. Эти результаты объясняют подергивание-опосредованной механизм миграции, который облегчает прикрепление клеток-клеток, агрегации и колонизации в пределаххозяин, в конечном итоге привести к системной инфекции.
Пиль-Чп оперон X. fastidiosa содержит pilG, Пили, pilJ, пилюлю, chpB и chpC , которые кодируют сигнал путей передачи 20. Трансмембранные хеморецепторы связывают химические раздражители в периплазмической области и активировать сигнальный каскад в их цитоплазматической части, чтобы в конечном счете управлять бактериальной подергивания моторику. В Пиль-Chp оперона X. fastidiosa, A фосфо-шатл белок PilG является гомологом к Чей. У Е. палочки и P. палочка, Chey является регулятором ответ на хемотаксис систем , которые взаимодействуют с жгутиков моторных белков 19, 21. Несмотря на то, вклады оперона Пиль-Chp по отношению к вирулентности в X. fastidiosa были недавно рассмотрены 20, роль pilG в хемотаксиса оперона в ответ на внешние сигналы и регулируемой / двигателя тип IV фимбрий из X. fastidiosa является ункцииЛир. Для выяснения понимания регулятора хемотаксис pilG активности подергивание моторики X. fastidiosa, микро фл uidic камера используется для оценки подергивания моторику X. fastidiosa. PilG из X. fastidiosa характеризуется сравнением фенотипов делеционного мутанта Xf ΔpliG, комплементарный штамм XfΔpliG -С и его дикого типа в пробирке. Результаты свидетельствуют о роли pilG в подергивания моторики X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данном исследовании мы характеризовали поведение движени X. fastidiosa PilG мутант Xf ΔpilG и его комплементарные штаммы XfΔpilG- C в новой конструкции с несколькими микро параллельно-нано-канал фл uidic камер. Недавно разработанная микро эт uidic камеры могут иметь до четырех п…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Департаментом сельского хозяйства Соединенных Штатов, Службы сельскохозяйственных исследований. Торговые наименования или коммерческие продукты, в данной публикации упоминаются исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Соединенных Штатов департамента сельского хозяйства. Министерство сельского хозяйства США равные возможности и работодателем.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
References
- Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
- Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
- Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
- Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
- Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
- Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
- Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
- Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
- Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
- Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent ‘stick-and-roll’ adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
- Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).
- Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
- DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
- Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
- Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
- Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
- Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
- Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
- Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
- Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
- Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce’s Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
- Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).
