La visualización de Contracciones Motilidad y caracterización del papel de la<em> Pilg</em> en<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
En este estudio, se empleó una cámara de flujo nano-microfluidos de visualizar y caracterizar funcionalmente la motilidad espasmos de Xylella fastidiosa, una bacteria que causa la enfermedad de Pierce en la vid.
Abstract
Xylella fastidiosa es una bacteria no flagelado Gram-negativa que provoca una serie de enfermedades económicamente importantes de plantas. La motilidad espasmos ofrece X. fastidiosa un medio para el movimiento de larga distancia dentro de la planta y la colonización, que contribuye a la patogenicidad en X. fastidiosa. La motilidad espasmos de X. fastidiosa es operado por pili de tipo IV. Pili de tipo IV de Xylella fastidiosa están regulados por Pilg, un regulador de la quimiotaxis de Pil-CHP proteínas operón codificación que están involucrados con las vías de transducción de señales. Para dilucidar el papel de los Pilg en la motilidad espasmos de X. fastidiosa, una Pere-deficiente mutante Xf ΔpilG y su cepa complementaria XfΔpilG- C que contiene nativa Pilg se desarrollaron. A las cámaras de microfluidos integrados con un sistema de grabación de la imagen de lapso de tiempo fue utilizado para observar la motilidad espasmos en XfΔpIlg, XfΔpilG- C y su cepa de tipo salvaje. El uso de este sistema de grabación, que permite observaciones espaciales y temporales a largo plazo de la agregación, la migración de las células y las poblaciones de bacterias a través de la motilidad espasmos individuales. X. de tipo salvaje y fastidiosa cepa complementaria XfΔpilG- C mostraron características típicas contracciones de la motilidad observados directamente en las cámaras de flujo de microfluidos, mientras que el mutante XfΔpliG exhibe el fenotipo deficiente espasmos. Este estudio demuestra que Pilg contribuye a la motilidad espasmos de X. fastidiosa. La cámara de flujo de microfluidos se utiliza como un medio para la observación de la motilidad espasmos.
Introduction
Xylella fastidiosa es una bacteria Gram-negativa no flagelado, patógeno que causa una serie de enfermedades de los cultivos económicamente importantes, incluyendo la enfermedad de Pierce en la vid (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Esta bacteria se limita a la xilema conductor de agua vasos. La infección de la vid provoca la obstrucción de los vasos del xilema y resulta en estrés hídrico y las deficiencias nutricionales 3. La colonización exitosa depende de la capacidad de la bacteria para moverse desde el sitio inicial de la infección con el resto de la planta 3. Contracciones la motilidad es un medio de movimiento flagelar bacteriano-independiente a través de la extensión, el apego y la retracción de la IV pili de tipo polar 4 que se ha caracterizado en X. 5,6,7 fastidiosa.
La motilidad espasmos ha sido observado por pinzas láser y microscopía de fuerza atómica (AFM) 8,9,10. Utilizando estas técnicas, tmotilidades witching generado por tipo IV pilus de N. gonorrhoeae y P. aeruginosa se caracteriza por fl pili etiquetado uorescently y la captura de sus movimientos al microscopio. Aunque ambos métodos han detallado la fuerza de adhesión de las bacterias individuales, los procedimientos son complicados y consume mucho tiempo 9,10. Las cámaras uidic fl micro se utilizaron para observar la migración de larga distancia de las células individuales, así como pequeños agregados de células bacterianas 5,6. Estas cámaras se han diseñado como un nano-canal microfabricado en una placa integrada con un lapso de tiempo 11,12,13,14 sistema de grabación de imágenes. Micro fl dispositivos de cámara uidic ofrecen varias ventajas para el estudio de la conducta y el movimiento de célula a célula interacciones de las bacterias: (i) Proporciona una plataforma integrada que tiene múltiples capacidades de canal; (Ii) le corresponde examinar las mociones y agregaciones de células individuales en las características de escala nanométrica de las bacterias; (Iii) que permite m directaicroscopic grabación de imágenes de las células bacterianas y realizar un análisis cronológico, (iv) que proporciona observaciones espaciales y temporales a largo plazo de las poblaciones individuales y / o de bacterias en un micro-ambiente; (V) la velocidad de flujo de medio de cultivo en un canal puede ser controlada con precisión y es necesario (vi) solamente un volumen muy pequeño (1 ml) de medio de cultivo para cada experimento.
Recientemente, la micro fl uidic flujo sistema se ha empleado para investigar el comportamiento de las células bacterianas bajo diversos microambientes 14,15,16. La adhesividad y el accesorio de superficie de E. coli 15, X. fastidiosa 16, y Acidovorax citrulli 14 a las superficies de vidrio se evaluaron utilizando cámaras uidic micro fl. La formación de agregación y bio fi lm mediada por pili de tipo IV de Acidovorax citrulli se analizaron 14. Además, el movimiento de A. citrulli observó bajo flujo condiciones demostraron que los pili de tipo IV puede desempeñar un papel importante en la colonización y la propagación de A. citrulli en los vasos del xilema savia bajo condiciones de flujo. Las contracciones motilidades de Pseudomonas aeruginosa y X. fastidiosa células se observaron con éxito contra una corriente de fluido en una cámara de flujo microfabricado 5,6,17. Tipo IV pilus deficiente PilB y pilQ mutantes de X. fastidiosa se encontraron a alterar profundamente la velocidad de la motilidad espasmos en las condiciones de fluencia en dispositivos micro fl uidic 5,6,18. Los estudios realizados sobre la adhesión bacteriana y la motilidad en dispositivos uidic fl micro indicaron que las cámaras uidic micro fl son particularmente adecuados para el análisis de la motilidad espasmos y la migración de bacterias mediada por pili in vitro. Estos resultados explican el mecanismo de la migración mediada por contracciones que facilita la fijación célula-célula, la agregación y la colonización dentro deel anfitrión, eventualmente conducir a la infección sistémica.
Pil-CHP operón de X. fastidiosa contiene Pilg, Pili, pilJ, píldora, chpB y CHPC el que la transducción de señales codifican las vías 20. Los quimiorreceptores transmembrana se unen estímulos químicos en el dominio periplásmico y activan una cascada de señalización en su porción citoplasmática de controlar en última instancia, la motilidad bacteriana espasmos. En el operón pil-CHP de X. fastidiosa, una proteína Pilg fosfo-lanzadera es un homólogo de CheY. En E. coli y P. aeruginosa, CheY es el regulador de la respuesta de quimiotaxis en los sistemas que interactúan con las proteínas motoras flagelos 19, 21. A pesar de las contribuciones del operón pil-CHP hacia la virulencia en X. fastidiosa se examinaron recientemente 20, el papel de Pilg en operón quimiotaxis en respuesta a las señales del medio ambiente y para regulada / motor de tipo IV pili de X. fastidiosa es uncLear. Para dilucidar la visión del regulador de la quimiotaxis Pilg en la actividad de la motilidad espasmos de X. fastidiosa, una cámara de uidic fl micro se utiliza para evaluar la motilidad espasmos de X. fastidiosa. El Pilg de X. fastidiosa se caracteriza mediante la comparación de los fenotipos de un mutante de deleción Xf ΔpliG, cepa complementaria XfΔpliG -C y su tipo salvaje in vitro. Los resultados ponen de manifiesto el papel de Pilg en la motilidad espasmos de X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos caracterizado el comportamiento de movimiento de X. fastidiosa Pilg mutante Xf ΔpilG y sus complementarias cepas XfΔpilG- C de nuevo diseño en-nano-canales paralelos múltiples cámaras micro fl uidic. Las cámaras uidic de nuevo diseño micro FL puede tener hasta cuatro cámaras paralelas con 100 micras nano-canal de ancho en comparación con diseños anteriores con solo un 50 micras de ancho del canal 18. Cuanto más amplia sea la nano-c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola. nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación se mencionan únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica ninguna recomendación o aprobación por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
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