Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em> In vitro</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
Hémostase exige l'activité combinée et régulée des cellules, des protéines, des ions et des tissus dans un contexte spatiotemporel limité 1. une activité non contrôlée peut conduire à une hémorragie ou d'une thrombose et de la morbidité ou de la mortalité dans un spectre de troubles liés à la coagulation du sang. Une expérience de la chambre d'écoulement microfluidique est une technique difficile qui imite l' hémostase in vitro. Cette approche permet d'étudier l'interaction complexe des processus qui prennent part à l'hémostase avec un rôle de premier plan pour les plaquettes sanguines.
Suite à une lésion vasculaire, les plaquettes adhèrent aux protéines matrice sous-endothéliale exposée (glyco) pour empêcher la perte de sang. À la suite de l' adhérence, les plaquettes d' activer et de l' agrégat en réponse à la signalisation automobile et paracrine qui conduit finalement à la formation d'un réseau de plaquettes stabilisées par la fibrine et résultant en un solide, d'une plaie 2 thrombus d' étanchéité. Contrairement à la plupart des autres tests de la fonction plaquettaire, EXPERIments avec des chambres d'écoulement prennent en compte le paramètre physique de l' écoulement sanguin et par conséquent l'influence de la rhéologie dans les cellules participant biomolécules et 3,4.
expériences en chambre de débit ont généré des idées marquantes de l'hémostase et de la thrombose en faisant varier les paramètres clés qui influencent hémostatique (sub) processus, y compris les profils matrice adhésive, rhéologie et de débit, la composition cellulaire, la présence de toxines ou des médicaments, la force ionique et beaucoup plus. Au cours des deux dernières décennies, à faible débit des expériences en chambre d'écoulement nécessitant des volumes d'échantillons de grande taille (10-100 ml) ont évolué vers des chambres microfluidiques souvent constituées de petites chambres à plaques parallèles et dont la technologie moderne pour perfuser le sang total dans des conditions mur de cisaillement contrôlées 5. Microscaling a augmenté de façon significative le débit dosage surtout parce que la configuration matérielle a simplifié et moins (sang) volume est nécessaire, ce qui rend l'expérience Versati plus accessible etle. Par exemple, le sang de petits animaux de laboratoire peut maintenant être utilisé sans qu'il soit nécessaire de sacrifier les animaux. Des échantillons de sang de souris génétiquement modifiées ont ainsi contribué à l'identification de molécules clés favorisant ou inhibant l' hémostase et de nouvelles idées de base 6.
Les laboratoires de recherche spécialisés souvent utilisent encore sur mesure chambres d'écoulement , par exemple de polydiméthylsiloxane (PDMS) 7 qui polymérise sur des moules lithographiées qui peuvent être blueprinted par le logiciel. La chambre résultant est peu coûteux, jetable et peut être facilement démonté pour analyse post-hoc. En outre, essentiellement toute la conception des navires, y compris les bifurcations ou des virages serrés peut être construit sur commande. Cet avantage est aussi son inconvénient puisque la normalisation était déjà le principal problème avec les expériences de la chambre d'écoulement et PDMS sur mesure chambres n'ont pas aidé cela. En plus de cette question particulière, le revêtement (conditions), des sondes fluorescentes, anticoagulant, templit- et le temps entre le prélèvement et l' analyse sont tous mal standardisés 8. La normalisation de ces variables est difficile, mais néanmoins nécessaire pour permettre la comparaison des résultats entre les laboratoires. Ce sujet est le principal objet de la Société internationale de thrombose et d' hémostase au sous-comité scientifique et de la normalisation sur Biorheology 9,10.
Les concentrés plaquettaires (PC) sont transfusées chez les patients souffrant de diverses maladies qui causent la thrombocytopénie et / ou des saignements. Mais les plaquettes dans le PC sont connus pour désensibiliser, en particulier en fonction du temps de stockage 11, un processus de dégradation liée au vieillissement et communément appelée lésion de stockage des plaquettes. On prétend parfois que ces plaquettes restaurer en circulation une fois transfusé 12, mais la preuve de ceci est rare. En outre, la fonctionnalité des plaquettes constituant un PC ne sont pas systématiquement testé car la relation entre ces essais etl' efficacité thérapeutique ou prophylactique ne sait pas 13. chambres d'écoulement microfluidiques offrent un moyen d'enquêter sur la fonction plaquettaire dans le PC pour optimiser la chaîne de manipulations entre la collecte et la délivrance. Il est un puissant outil de recherche pour (appariés) des comparaisons directes de PC comme nous l' avons déjà publiés 14,15 et est décrite ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluidiques expériences en chambre d'écoulement sont un excellent outil pour étudier la fonction plaquettaire dans le sang circulant et sont utilisés pour évaluer l' hémostase in vitro dans des contextes expérimentaux. Malgré une mauvaise standardisation interlaboratoires 9, nous démontrons que , dans notre laboratoire , la variation expérimentale est acceptable. Ceci permet de comparer de manière fiable des échantillons (appariés) dans une étude donnée. Ceci a été valid?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers – a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
