Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
המוסטאסיס מחייב פעילות המשולבת ומוסדר של תאים, חלבונים, יונים ורקמות בהקשר spatiotemporal הוגבל 1. פעילות מבוקרת עלולה להוביל לדימום או פקקת ותחלואה או תמותה בתוך הספקטרום של הפרעות הקשורות לקרישת דם. ניסוי תא זרימת microfluidic הוא טכניקה מאתגרת מחקה המוסטאסיס במבחנה. גישה זו מאפשרת חקירה של יחסי הגומלין המורכבים של תהליכים להשתתף המוסטאסיס עם תפקיד מוביל עבור טסיות דם.
בעקבות פציעה של כלי דם, טסיות לדבוק מטריקס subendothelial החשוף (glyco) חלבונים על מנת למנוע אובדן דם. בעקבות הידבקות, טסיות להפעיל המצרפי בתגובה אוטומטית ואיתות paracrine אשר בסופו של דבר מוביל להיווצרות של רשת טסיות, על מנת לייצב את הפיברין וכתוצאה מכך משרד, פצע איטום פקיק 2. בניגוד לרוב בדיקות תפקוד טסיות אחרות, התנסותמפעלים עם תאי זרימה לקחת בחשבון את הפרמטר הפיזי של זרימת הדם ולכן השפעת rheology על תאים המשתתפים ביומולקולות 3,4.
ניסויי תא זרימה יצרו תובנות ציון דרך המוסטאסיס ופקק על ידי שינוי פרמטרים מרכזיים משפיעים (תת) עוצר דמום תהליכים, כולל מטריצה הדבקה, פרופילי rheology וזרימה, הרכב הסלולר, הנוכחות של רעלים או סמים, כוח יוני ועוד רבים. בשני העשורים האחרונים, ניסויי תא זרימה נמוכה תפוקה מחייבת כרכי מדגם גדולים (10-100 מיליליטר) התפתחו תאי microfluidic לעתים קרובות מורכב של תאי לוחות מקבילים קטנים וכוללים טכנולוגיה מודרנית עבור מרוססת דם מלא בתנאי גזירת קיר מבוקרים 5. Microscaling גדל באופן משמעותי את תפוקת assay בעיקר מפני התקנת החומרה פשטה ופחות נפח (דם) נדרש, טיוח הניסוי לנגיש יותר versatile. למשל, דם בחיות מעבדה קטנות כעת ניתן להשתמש ללא צורך להקריב בעלי חיים. דגימות דם של עכברים מהונדסים גנטית ובכך סייעו בזיהוי מולקולות מפתח קידום או עיכוב המוסטאסיס וב תובנות בסיסיות רומן 6.
מעבדות מחקר מיוחדים לעתים קרובות עדיין להשתמש בתאי לזרום בהתאמה אישית למשל מ polydimethylsiloxane (PDMS) 7 כי polymerizes על תבניות lithographed אשר ניתן blueprinted ידי התוכנה. התא וכתוצאה מכך הוא זול, חד פעמי יכול להיות מפורקים בקלות לניתוח פוסט הוק. יתר על כן, בעצם כל עיצוב של כלי, bifurcations כולל או פניות חדות יכול להיבנות על פי פקודה. יתרון זה הוא גם החסרון שלה מאז סטנדרטיזציה כבר הייתה הבעיה העיקרית עם ניסויי תא זרימה, ו PDMS בהתאמה אישית בתאים לא סייעו זה. נוסף על הנושא המסוים הזה, ציפוי (תנאים), בדיקות ניאון, נוגד קרישה, טמפ 'erature והזמן בין דיגום ואנליזה כולם גרוע טופלו 8. התקינה של משתנים אלה הוא מאתגר, אבל בכל זאת נדרש להתיר השוואה של התוצאות בין המעבדות. נושא זה הוא הנושא העיקרי של האגודה הבינלאומית על פקקת ו haemostasis ב ועדת משנה מדעי ותקינה על Biorheology 9,10.
תרכיזים טסיות (PC) הם בעירוי בחולים הסובלים ממחלות שונות הגורמות תרומבוציטופניה ו / או דימום. אבל טסיות PC ידועה להוריד את רמת רגישות, במיוחד פונקציה של זמן אחסון 11, תהליך הידרדרות צמוד הזדקנות המכונה גם נגע אחסון טסיות. לעתים הוא טען כי טסיות כגון לשחזר במחזור בעירוי פעם 12, אבל הראיות לכך הוא נדיר. יתר על כן, את הפונקציונליות של טסיות ממציא מחשב אינה נבחנה שיגרתית משום שהיחסים בין מבחנים כאלהיעילות טיפולית או מניעת מחלות היא 13 ברור. תאי זרימה microfluidic להציע אמצעי לחקור את תפקוד הטסיות במחשב כדי לייעל את שרשרת מניפולציות בין איסוף המנפיקה. זהו כלי מחקר רב עוצמה עבור השוואה ישירה (זיווג) של המחשב כפי שפרסמנו בעבר 14,15 והוא מתואר כאן.
ניסויי תא זרימת microfluidic הם כלים מצוינים כדי לחקור את תפקוד הטסיות ב זורם דם משמשים כדי להעריך המוסטאסיס במבחנה בהקשרי ניסיוני. למרות סטנדרטיזציה עני מעבדתיות 9, אנו מראים כי בתוך המעבדה שלנו וריאצית ניסיוני מקובל. זה מאפשר להשוות באופן מהימן (זיווג) דגימות ב…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Pipette | Brand | A03429 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vortex | VWR | 58816-121 |