Microfluidic प्रवाह कक्षों पुनर्गठन रक्त का उपयोग Hemostasis और प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन मॉडल<em> इन विट्रो</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
रक्तस्तम्भन एक प्रतिबंधित spatiotemporal संदर्भ 1 में कोशिकाओं, प्रोटीन, आयनों और ऊतकों के संयुक्त और विनियमित गतिविधि की आवश्यकता है। अनियंत्रित गतिविधि रक्त जमावट से संबंधित विकारों की एक स्पेक्ट्रम में रक्तस्राव या घनास्त्रता और रुग्णता या मृत्यु दर को जन्म दे सकता है। एक microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोग एक चुनौतीपूर्ण तकनीक है कि इन विट्रो में रक्तस्तम्भन mimics है। यह दृष्टिकोण प्रक्रियाओं है कि ब्लड प्लेटलेट्स के लिए एक प्रमुख भूमिका के साथ रक्तस्तम्भन में भाग लेने के जटिल परस्पर क्रिया की जांच की अनुमति देता है।
संवहनी चोट के बाद, प्लेटलेट्स खून की कमी को रोकने के लिए अवगत कराया subendothelial मैट्रिक्स (glyco) प्रोटीन का पालन करें। आसंजन के बाद, प्लेटलेट्स को सक्रिय करने और जवाबी कार्रवाई में कुल ऑटो और पैराक्राइन संकेतन जो अंत में एक प्लेटलेट नेटवर्क के गठन, आतंच द्वारा स्थिर और एक फर्म में जिसके परिणामस्वरूप की ओर जाता है, सील thrombus 2 घाव। अधिकांश अन्य प्लेटलेट समारोह परीक्षण, अनुभव के विपरीतप्रवाह कक्षों के साथ बयान खाते में रक्त के प्रवाह के भौतिक पैरामीटर और इसलिए भाग लेने कोशिकाओं और biomolecules 3,4 पर rheology के प्रभाव ले।
प्रवाह कक्ष प्रयोगों मुख्य मापदंडों को प्रभावित hemostatic (उप) चिपकने वाला मैट्रिक्स, rheology और प्रवाह प्रोफाइल, सेलुलर संरचना, जहर या ड्रग्स, आयनिक शक्ति और बहुत से अधिक की उपस्थिति सहित प्रक्रियाओं अलग से रक्तस्तम्भन और घनास्त्रता में मील का पत्थर अंतर्दृष्टि उत्पन्न किया है। पिछले दो दशकों में, कम throughput प्रवाह कक्ष बड़ा नमूना संस्करणों (10-100 एमएल) की आवश्यकता होती है प्रयोगों अक्सर छोटे समानांतर प्लेट कक्षों से मिलकर और नियंत्रित दीवार कतरनी की स्थिति 5 पर पूरे रक्त perfusing के लिए आधुनिक प्रौद्योगिकी सहित microfluidic कक्षों को विकसित किया है। Microscaling काफी परख throughput बढ़ गया है, क्योंकि ज्यादातर हार्डवेयर सेटअप को सरल बनाया गया है और कम (खून) की मात्रा की आवश्यकता होती है, प्रयोग और अधिक सुलभ और Versati प्रतिपादनle। उदाहरण के लिए, छोटी प्रयोगशाला जानवरों से खून अब जानवरों को बलिदान करने के लिए आवश्यकता के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के रक्त के नमूने इस प्रकार को बढ़ावा देने या रक्तस्तम्भन बाधा कुंजी अणुओं की पहचान करने में और उपन्यास बुनियादी अंतर्दृष्टि 6 में हुई है।
विशेष अनुसंधान प्रयोगशालाओं अक्सर अभी भी polydimethylsiloxane (PDMS) 7 कि lithographed नए नए साँचे जो सॉफ्टवेयर द्वारा blueprinted जा सकता है पर polymerizes से उदाहरण के लिए कस्टम मेड प्रवाह कक्षों का उपयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप कक्ष, सस्ती डिस्पोजेबल है और आसानी से पोस्ट अस्थायी विश्लेषण के लिए disassembled किया जा सकता है। इसके अलावा, मूल रूप से जहाजों, bifurcations सहित या तेज बदल जाता है की किसी भी डिजाइन आदेश पर बनाया जा सकता है। यह लाभ भी इसके नकारात्मक पहलू के बाद से पहले से ही मानकीकरण प्रवाह कक्ष प्रयोगों के साथ प्राथमिक समस्या थी, और PDMS कस्टम कक्षों इस सहायता प्राप्त नहीं किया है बनाया है। इस विशेष मुद्दे के शीर्ष पर, कोटिंग (स्थिति), फ्लोरोसेंट जांच, थक्कारोधी, अस्थायी परerature और नमूना और विश्लेषण के बीच के समय सभी खराब 8 मानकीकृत कर रहे हैं। इन चर के मानकीकरण चुनौती दे रहा है, लेकिन फिर भी प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना की अनुमति के लिए जरूरी है। इस विषय को Biorheology 9,10 पर वैज्ञानिक और मानकीकरण उपसमिति में घनास्त्रता और Haemostasis पर इंटरनेशनल सोसायटी के प्रमुख विषय है।
प्लेटलेट ध्यान केंद्रित (पीसी) विभिन्न रोगों कि थ्रोम्बोसाइटोपेनिया और / या रक्तस्राव का कारण से पीड़ित रोगियों में चढ़ाया जाता है। लेकिन पीसी में प्लेटलेट्स, असंवेदनशील करने के लिए जाना जाता है, विशेष रूप से भंडारण समय 11 के समारोह में गिरावट उम्र बढ़ने की प्रक्रिया है और आमतौर पर प्लेटलेट भंडारण घाव के रूप में संदर्भित करने के लिए जुड़ा हुआ है। यह कभी कभी दावा किया है कि इस तरह के प्लेटलेट्स प्रचलन एक बार चढ़ाया 12 में बहाल है, लेकिन इस के लिए सबूत दुर्लभ है। इसके अलावा, एक पीसी बनाने प्लेटलेट्स की कार्यक्षमता नियमित रूप से परीक्षण नहीं किया गया है क्योंकि इस तरह के assays और बीच के रिश्तेचिकित्सीय या रोगनिरोधी प्रभावकारिता स्पष्ट नहीं 13 है। Microfluidic प्रवाह कक्षों पीसी में प्लेटलेट समारोह की जांच करने के लिए संग्रह और जारी करने के बीच जोड़तोड़ की श्रृंखला अनुकूलन करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं। यह प्रत्यक्ष (बनती) पीसी की तुलना में हम पहले 14,15 प्रकाशित किया है और यहाँ वर्णित है के लिए एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोगों खून बहने में प्लेटलेट समारोह की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं और प्रयोगात्मक संदर्भों बदलती में इन विट्रो में रक्तस्तम्भन मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
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