マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em>インビトロ</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
止血は制限された時空間コンテキスト1で細胞、タンパク質、イオンと組織の組み合わせと調整活動が必要です。制御されていない活動は、血液凝固に関連する疾患のスペクトルに出血や血栓症および罹患率や死亡率につながる可能性があります。マイクロ流体フローチャンバー実験は、 インビトロで止血を模倣困難な技術です。このアプローチは、血小板のための先導的な役割で止血に参加するプロセスの複雑な相互作用の調査を可能にします。
血管損傷後、血小板は血液の損失を防止するために、露出した内皮下マトリックス（糖）タンパク質に付着します。接着に続いて、血小板が最終的にフィブリンおよび事務所の結果によって安定化された血小板のネットワークの形成につながるシグナル伝達を自動およびパラクリンに応答して活性化し、骨材、血栓2を封止巻か。他のほとんどの血小板機能検査、experiとは異なり、フローチャンバーを持つメントは、アカウントへの血流の物理的パラメータ、したがって、参加した細胞や生体分子3,4上のレオロジーの影響を取ります。
チャンバー実験フロー止血（サブ）に影響の重要なパラメータを変化させることによって、止血および血栓症の中で画期的な洞察を生成した接着剤マトリックス、レオロジー及び流れプロファイル、細胞組成、毒素または薬物、イオン強度および多くの存在を含む処理されます。過去20年間では、大規模なサンプル容量（10〜ml）を必要とする低スループットフローチャンバー実験は、多くの場合、小さな平行板室からなり、制御された壁面せん断条件5で全血を灌流するための近代的な技術を含むマイクロ流体室に進化してきました。ハードウェアのセットアップを簡略化しており、以下（血液）のボリュームが必要とされる主な理由Microscalingが大幅に実験をよりアクセスし、versatiレンダリング、アッセイのスループットを増加していますル。例えば、小型の実験動物からの血液は、現在、動物を犠牲にすることなく使用することができます。遺伝的に改変されたマウスの血液サンプルは、このように止血を促進または阻害鍵分子の同定におよび新規の基本的な洞察6に支援しています。
専門の研究室は、多くの場合、まだソフトウェアによってblueprintedすることができリトグラフ金型に重合したポリジメチルシロキサン（PDMS）7からインスタンスのカスタムメイドのフローチャンバーを使用します。その結果、チャンバは、安価な使い捨てであり、容易に事後解析のために分解することができます。また、分岐点または鋭いターンを含む血管の基本的にはどのようなデザインは、コマンド上に構築することができます。この利点は、標準化は既にフローチャンバー実験と主要な問題であり、PDMSは、カスタムメイドの室がこれを支援していないので、その欠点です。この特定の問題、コーティング（条件）、蛍光プローブ、抗凝固剤、温度の上サンプリングと分析の間eratureと時間がすべての悪い8を標準化されています。これらの変数の標準化は、困難、それにもかかわらず、研究室間の結果の比較を可能にするために必要とされます。このトピックでは、生物レオロジー9,10に関する科学と標準化小委員会における血栓止血に関する国際社会の主要な対象です。
血小板濃縮物（PC）は、血小板減少症および/または出血を引き起こす様々な疾患に罹患している患者に輸血されています。しかし、PC中の血小板は、特に貯蔵時間11の関数で、脱感作することが知られており、劣化プロセスは、加齢および一般血小板貯蔵病変と呼ばに連結されました。時々 、このような血小板はかつて12輸血血液循環に復元することが主張されているが、これのための証拠は乏しいです。さらに、PCを構成する血小板の機能は、日常的にテストされていないため、このようなアッセイとの間の関係治療的または予防的有効性は13不明です。マイクロ流体フローチャンバーは、コレクションと発行間の操作のチェーンを最適化するために、PC内の血小板機能を調査するための手段を提供しています。それは我々が以前に14,15を公開しているし、ここに記載されているように、PCの直接（ペアリング）比較のための強力な研究ツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
マイクロ流体フローチャンバー実験は、血液の流れに血小板機能を調査するための優れたツールであり、実験的な文脈を変化させるインビトロでの止血を評価するために使用されます。貧しい施設間の標準化9にもかかわらず、我々は我々の研究室内実験変動が許容可能であることを示しています。これは確実に与えられた研究の範囲内（ペアリング）のサンプルを比較するこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
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