Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em> İn Vitro</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
Hemostaz kısıtlı zamanmekansal bağlamda 1 hücreleri, proteinler, iyonlar ve dokuların kombine ve düzenlenmiş aktivite gerektirir. Kontrolsüz etkinliği kan pıhtılaşması ile ilgili bozuklukların bir spektrum içinde kanama ve tromboz ve morbidite ve mortaliteye neden olabilir. Bir mikroakışkan akış odası deneyi in vitro hemostazisi taklit zorlu bir tekniktir. Bu yaklaşım, kan trombositlerin için öncü bir role sahip hemostaz katılan süreçlerin karmaşık etkileşimin soruşturma sağlar.
vasküler hasar ardından, trombositler, kan kaybını önlemek için maruz subendotelyal matris (gliko) proteinlere yapışır. Yapışma ardından, trombositler aktive ve yanıt olarak agrega matik ve nihayet bir trombosit ağının oluşumu, fibrin tarafından stabilize ve bir firmaya neden neden parakrin sinyal için, trombüs 2 sızdırmazlık yara. Diğer çoğu trombosit fonksiyon testleri, deney aksineAkış odaları ile ments dikkate kan akımının fiziksel parametre ve bu nedenle katılımcı hücreler ve biyomoleküllerin 3,4 tarihinde reolojinin etkisini alır.
Akış odası deneyleri yapışkan matrisi, reoloji ve akış profilleri, hücresel kompozisyon, toksinler veya ilaç, iyonik kuvvet ve daha birçok varlığı da dahil olmak üzere süreçler hemostatik (alt) etkileyen önemli parametreler değiştirilerek hemostaz ve tromboz dönüm noktası anlayışlar yarattı. Son yirmi yılda, büyük örneklem hacimleri (10-100 ml) gerektiren düşük verim akım odası deneyleri mikroakışkan odaları genellikle küçük paralel plaka odadan oluşan ve kontrollü duvar kesme koşullarında 5 de tam kan perfüze için modern teknolojiyi dahil etmek gelişmiştir. donanım kurulum basitleştirilmiş ve daha az (kan) hacmi gereklidir çoğunlukla nedeniyle Microscaling önemli ölçüde deneme daha erişilebilir ve Versati render tahlil verimi arttıle. Örneğin, küçük laboratuar hayvanlarından kan Böylece hayvanlar kurban gerek kalmadan kullanılabilir. Genetiği değiştirilmiş farelerin kan örnekleri böylece hemostaz teşvik veya inhibe anahtar moleküller belirlenmesinde ve yeni temel anlayışlar 6 yardımcı olmaktadır.
Özel araştırma laboratuarları çoğu hala yazılım tarafından blueprinted edilebilir Baskılı kalıplara polimerize polidimetilsiloksan (PDMS) 7 den, örneğin özel yapılmış akış odaları kullanın. Ortaya çıkan odası, ucuz tek kullanımlık ve kolayca post hoc analizi için demonte edilebilir. Ayrıca, temelde gemiler de dahil olmak üzere bifurkasyonlarında veya keskin dönüşler herhangi bir tasarım komutu üzerine inşa edilebilir. Bu avantaj da standardizasyon zaten akış odası deneyleri ile birincil sorun bu yana olumsuz ve PDMS özel odalar bu destekli değil yaptı. Bu belirli bir sorunun üstüne kaplama (şartlar), floresan probları, antikoagülan, geçici üzerindenumune alma ve analiz arasındaki kısa süreli olarak ve zaman tüm kötü 8 standardize edilmiştir. Bu değişkenlerin Standardizasyon zorlu ama yine de laboratuarlar arasında sonuçların karşılaştırılmasına olanak gerekmektedir. Bu konu Biorheology 9,10 Bilimsel ve Standardizasyon alt komite Tromboz ve hemostaz üzerine International Society önemli bir konudur.
Trombosit konsantreleri (PC) trombositopeni ve / veya kanamaya neden çeşitli hastalıklardan mustarip hastalarda transfüzyon. Ama PC trombositler özellikle depolama süresinin 11 işlevinde, duyarsız bilinen bir bozulma süreci yaşlanma ve yaygın olarak trombosit saklama lezyon olarak anılacaktır bağlantılı. Bazen bu tür plateletler kez 12 transfüzyon dolaşımda geri iddia edilmektedir, ancak bunun için kanıt azdır. Ayrıca, bir PC oluşturan trombosit işlevselliği rutin test değil çünkü bu tür tahliller arasındaki ilişkiterapötik ya da profilaktik etkisi açık 13'tür. Mikroakışkan akış odaları toplama ve ihracı arasındaki manipülasyonlar zincirini optimize etmek için PC trombosit fonksiyonlarını araştırmak için bir araç sunuyoruz. Biz daha önce 14,15 yayınlanmış ve burada tarif edildiği gibi PC doğrudan (eşli) karşılaştırmalar için güçlü bir araştırma aracıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroakışkan akış odası deneyleri kan akan trombosit fonksiyonlarını araştırmak için mükemmel bir araçtır ve deneysel bağlamlarda farklı in vitro hemostaz değerlendirmek için kullanılır. Fakir laboratuvarlar arası standardizasyonun 9 rağmen bizim laboratuvar içinde deneysel varyasyon kabul edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu güvenilir, belirli bir çalışma içinde (eşli) örnekleri karşılaştırmak için izin verir. Bu kan bankası koşullarında 11 trombos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers – a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
