Abstract
Det enteriska nervsystemet (ENS) spelar en viktig roll i regleringen av gastrointestinala (GI) motilitet och kan fungera oberoende av det centrala nervsystemet. Förändringar i ENS funktion är en viktig orsak till GI-symtom och sjukdomar och kan bidra till GI-symtom rapporterats i neuropsykiatriska störningar, inklusive autism. Det är väl etablerat att isolerade kolon segment genererar spontana, rytmiska sammandragningar kallas Colonic Migrera Motor Anläggningar (CMMCs). Ett förfarande för att analysera enter neurala regleringen av CMMCs i ex vivo preparat av mus kolon beskrivs. Kolon dissekeras från djuret och spolas för att avlägsna fekalt innehåll innan de kanyl i ett organbad. Data förvärvas via en videokamera placerad ovanför organbadet och omvandlas till högupplösta Spatiotemporal kartor via en intern programpaketet. Med hjälp av denna teknik, baslinjen sammandragande mönster och farmakologiska effekter på ENS funktion i tjocktarmen segments kan jämföras över 3-4 h. Dessutom kan spelas in utbrednings längd och hastighet CMMCs samt förändringar i tarmen diameter och kontraktion frekvens. Denna teknik är användbar för att karakterisera gastrointestinala motilitet mönster i transgena musmodeller (och i andra arter, inklusive råtta och marsvin). På detta sätt, är farmakologiskt inducerade förändringar i CMMCs registreras i möss av vildtyp och i Neuroligin-3 R451C musmodell av autism. Dessutom kan denna teknik kunna användas till andra regioner i mag-tarmkanalen, inklusive duodenum, jejunum och ileum och under de olika utvecklingsåldrar i möss.
Introduction
Det enteriska nervsystemet (ENS) är det inneboende neuronala nätverk av mag-tarmkanalen och modulerar olika funktioner såsom spjälkning av tarminnehållet, upptag av näringsämnen och den sekretion och reabsorption av fluid. Neuroner i ENS är belägna i myentericus och submukosala plexus. Den myenteric plexus spelar en viktig roll i regleringen av gastrointestinal motilitet en medan submukosala plexus är primärt involverad i kontrollen av utsöndringen 2,3. Plexus myentericus är belägen mellan de längsgående och cirkulära muskelskikten i mag-tarmväggen. Den kontraktila aktiviteten av de glatta muskelskikten i tarmväggen underlättar de primära funktionerna hos mag-tarmkanalen genom att blanda och snurrtarminnehåll utmed längden av tarmen 3. Även om den yttre nervtillförseln till mag-tarmkanalen från CNS bidrar till gastrointestinal funktion in vivoÄr ENS förmåga att reglera gastrointestinal funktion oberoende av varandra. Denna unika egenskap gör den funktionella undersökning av enter neuronala kretsar och deras bidrag till gastrointestinal motilitet ex vivo.
Kolon migrerande motorkomplex (CMMCs) är spontana, neurogena händelser som är den dominerande motor mönster som observerats i isolerade mus kolon i frånvaro av fekal pellets 4-9. CMMCs definieras som rytmiska sammandragningar som propagerar längs en horisontellt avstånd som är åtminstone hälften av den totala längden av tjocktarmen (dvs., från blindtarmen till ändtarmen) 10. Förhållandet mellan CMMCs och kontraktila mönster som driver fecal pellets ännu inte klart fastställas, men vissa farmakologiska skillnader har rapporterats 11. Ändå förmåga ENS att fungera oberoende av CNS och förekomsten av neurala-medierad motormönster i ISolated kolon är en idealisk analyssystem för att undersöka störningar i motilitet till följd av underliggande ENS dysfunktion. Spontanitet gastrointestinala motoriska mönster tillåter funktionella förändringar som svar på farmakologiska stimuli som ska utvärderas.
Användningen av video imaging och Spatiotemporal kartläggning utvecklades först för att kvantitativt undersöka små tarmperistaltik hos marsvin 12. Här är ett ex vivo beskrivna tekniken som gör det möjligt att studera mus kolon motilitet mönster med hjälp av video avbildning och analys av dessa inspelningar för att konstruera hög upplösning (~ 100 | im, 33 ms) kartor av kolon diameter som en funktion av läget längs kolon och tid (Spatiotemporal kartor). Använda egen programvara flankdetektering (Analyse2, tillgänglig på begäran), är data från full längd kolon segment upphandlande i realtid bearbetas för att generera Spatiotemporal kartor för varje experiment. I detta steg, video (AVI) filer summatecknat och omvandlas till Spatiotemporal kartor med Analyse2. Spatiotemporal kartor (Figur 2) visar kontraktilitet över tiden och möjliggör mätning av flera parametrar inklusive utbredningshastigheten, magnitud, längd och varaktighet. Gut diameter är också registreras under hela varaktigheten av experimentet som ett mått på den totala kontraktilitet av vävnaden segmentet. Denna metod kan användas för att identifiera skillnader i tidpunkten för initiering av kontraktila komplex som kan tyda på förändrad enter neurala anslutning.
En liknande video imaging protokoll som syftar till att bedöma pellets framdrivning hos marsvin har rapporterats 13 men här vi redogöra för tillämpningen av videoavbildningsteknik för kvantifiering av spontan motilitet i kolon (dvs i frånvaro av pellets). Vi tillhandahåller också detaljerad information för att hjälpa dissekering och beredning av mag-tarmvävnad för videoavbildningsteknik. Dettaprotokollet förser forskare med en lättillgänglig och lätt kopieras verktyg för att analysera enter neurala kontrollen av gastrointestinal funktion i djurmodeller av sjukdomen, inklusive genetiska musmodeller.
Videoavbildningsteknik möjliggör analysen av motilitet i kolon som svar på olika farmakologiska medel. Läkemedel kan administreras via tarmlumen eller organbadet utanför tarmrengöringen. Olika regioner av mus magtarmkanalen uppvisar specifika motilitet mönster såsom små tarmsegmentering och CMMCs i kolon.
Denna teknik har använts för att identifiera stamskillnader i små tarmfunktion; differentiell känslighet för 5-HT 3 och 5-HT4-antagonister observerades i jejunum hos Balb / c och C57 / BL6-möss på grund av den polymorfa naturen hos TPH2-genen uttrycks i de två stammarna 6. Effekten av 5-HT hämning på motilitet förblir conkontroversiellt, eftersom motstridiga uppgifter har rapporterats om vikten av endogena 5-HT på kolon peristaltiken och CMMCs 14,15. Förändringar i motilitet pre- och postnatalt under utveckling 7, och effekterna av genmutationer på gastrointestinal motilitet i djurmodeller av sjukdom 10 kan också undersökas genom att använda video avbildning. Här visar vi användning av metoden för en studie av kolonrörlighet i musmodellen NL3 R451C av autism, som uttrycker en missense-mutation i Nlgn3 gen som kodar synaptiska adhesionsproteinet Neuroligin-3 16. Denna mutation identifierades först hos patienter med diagnosen autism (ASD) 17, som är starkt förknippad med GI dysfunktion 18-22. Vi undersökte huruvida NL3 R451C synaptiska mutation påverkar neurala utgångar i ENS använder videoavbildningsteknik. Vi presentera data som kännetecknar CMMCs vid baslinjen och som svar på det serotonerga 5HT 3/4 receptorantagonist tropisetron i musmodell av autism NL3 R451C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurhantering och halsdislokation av djur före alla experiment utfördes helt i enlighet med protokoll som godkänts av djurförsöks kommittén för University of Melbourne (Ethics ID: 1.212.494,7)
1. Tissue Insamling och Dissection
- Avliva vuxna möss genom cervikal dislokation. Om möjligt undvika anestesi för att förhindra påverkan på tarmfunktion via receptorer belägna på neuronala populationer av intresse.
- Registrera djurets totala kroppsvikten, stift kroppen (via de fyra tassar, ventralsidan utsätts för försöksledaren) stadigt mot en dissektion styrelse med hjälp av injektionsnålar (Storlek: 20 G).
- Med hjälp av dissekera pincett och sax, gör ett snitt genom epidermis överliggande de nedre buken muskellager. Fortsätt att använda pincett och sax för att öppna bukhålan längs mittlinjen av buken till bröstbenet.
- För att förhindra att vävnaden uttorkande, häll physimiologiska saltlösning (Krebs lösning: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO 4, en NaH 2 PO 4, 25 NaHCOa 3, 11 D-glukos i mM - bubblades vid RT med karbogen gas; 95% O2 och 5 % CO2 under minst 20 min) på buken innehållet med jämna mellanrum (det vill säga, varje 30-60 sek) under dissektion processen.
- För att isolera kolon medan ansluten till blindtarmen och ändtarmen, håller blindtarmen (beläget intill den proximala änden av kolon) försiktigt med dissekera pincett ca 4-5 cm ovanför kroppen av djuret medan trimning tarmkäxet med fina dissektion sax.
- Se till att inte hantera, sträcka eller skära gastrointestinal vävnad när du tar bort den angränsande tarmkäxet.
- Ta bort överflödig vävnad (dvs urinblåsan och testiklar). Använda grova dissekera sax, göra två vertikala snitt (dvs ca 0,5 cm från mittlinjen) att skära bäckenbenet på each sida av kolon.
- Använd fin sax för att separera ändtarmen från angränsande bäcken vävnad och trimma omgivande muskler från tjocktarmen.
- Placera fullängds kolon (från blindtarmen till ändtarmen) i en bägare innehållande fysiologisk saltlösning (tidigare syresatt med karbogen) och fortsätt att syre vid RT. Ta bort blindtarmen och ändtarmen med fina dissekera sax och ersätta i bägaren.
- Tomma fekal pellets / tarminnehållet från kolon preparat genom ett lätt positivt tryck vid den muntliga ände med hjälp av en 5 ml spruta kopplad till en 200 mikroliter pipettspets fylld med fysiologisk saltlösning. I syfte att orientera vävnaden i framtiden använda en insekt stift för att markera den mest proximala änden av tjocktarmen, där strimmor i slemhinnan är synliga.
- Modifiera plasten pipettspetsen för att passa 5 ml spruta genom att avlägsna ungefär en cm av den bredaste / proximala änden med hjälp av ett rakblad. För att öka flödet, bredda den distala / mindre änden genom att skära på en angle (ca 45 ° C) med ett rakblad.
- Gripa tag i kolonvävnad försiktigt vid dess proximala ände med dissekera pincett, sätt pipettspetsen in i lumen av kolonen och spola fysiologisk saltlösning genom lumen.
2. Beredning av kolonvävnad och experimentell inrättas för Video Imaging
- Flush fysiologisk saltlösning genom alla slangarna fäst till en två kammar organbad inrättas (figur 1 och figur 3), med användning av en spruta fäst till en 200 mikroliter pipettspets. Detta steg avlägsnar allt skräp inuti röret som skulle kunna blockera flödet av lösningen. För slang specifikationer hänvisas till tabellen material.
- Se till att kamrarna i organbadet kontinuerligt superfuseras med fysiologisk saltlösning bubblade med karbogen (95% O 2 och 5% CO2, flödeshastighet av 5 ml min -1). Med användning av en temperatursond med jämna mellanrum, se till att temperature av badet upprätthålls mellan 33 ° C -37 ° C.
- Fyll inflödet reservoaren är ansluten via en 3-vägskran till inloppsröret med ca 20-30 ml fysiologisk koksaltlösning med användning av en 50 ml spruta.
- Under experimentet hålla trycket i inflödesreservoaren med hjälp arubber propp med ett glasrör (5 mm innerdiameter) som är införd genom dess centrum. Se till att den övre öppningen av inflödet behållaren är ordentligt förseglad (med den inre glasröret förblir oförseglade).
- Placera kolon (längd 5-7 cm) i organbadet kammaren, att se till att den är helt nedsänkt i fysiologisk koksaltlösning.
- Cannulate varje ände av kolon segmentet till de två nedsänkta inlopps / utloppsrören (inlopps / utloppsrören med olika diameter kan ändras i enlighet med storleken av vävnadslumen t.ex.. Postnatal vävnad, vuxna möss och marsvin) i badet med användning av standard bomull sytråd. Fästa den proximala änden av tjocktarmen till inloppsröret ochdistala änden av tjocktarmen till utloppsröret (ansluten via en 3-vägs kran till ett vertikalt utflöde rör; 6 cm i höjd). Se till att vävnaden inte är överbelastade eller för avslappnad efter kanyle för att undvika störningar med framtida mätningar och analyser.
- Registrera längden av tjocktarmen genom att mäta avståndet mellan de proximala och distala kanyle med användning av en 15 cm linjal. Detta är viktigt för att tolka förändringar i sammandragning längd, utbredningshastighet och kontraktion initieringspunkter.
- Garantera en stabil baslinje luminal tryck (cm H2O) upprättas innan experimentet. Beräkna luminala tryck genom att mäta det vertikala avståndet från vävnaden till menisken av fysiologisk saltlösning i glasröret hos inflödesreservoar (oralt) och den vertikala utflödesröret (anal).
- Bibehålla vävnadspreparat vid ett konstant intraluminal tryck (t.ex., 1 till 2 cm H2O) genom att säkerställa att inflödet proppen tätningen pressure hålls konstant och att inga blockeringar är närvarande i uppsättningen upp.
- Låt kolon till jämvikt i fysiologisk saltlösning under 30 minuter innan inspelningen tarmrörelser. Kontrollera om det finns blockeringar som uppstår i in- eller utflödesrören och ta bort dem genom att applicera tryck genom inflödet reservoar eller genom återkanyle muntliga och anal ändar i tjocktarmen.
3. Bildinsamling och experimentell protokoll
- Spela tarmrörelser som videofiler med hjälp av en videokamera (30 bilder / sekund, 640 x 840 pixlar) placerade 10-15 cm ovanför organbadet på en standardlaboratorie retort stå (Figur 1).
- Öppna Virtual Dub (videoinspelning programvara) från ikonen på skrivbordet. Från "Arkiv", välj "capture AVI" för att visa kamerabilden. På "Audio fliken Avmarkera" möjliggöra ljudinspelning "att stänga av ljudet.
- På fliken video välj "komprimering" och "DivX6.9.2. Codec & #39; att komprimera videofiler för att minimera användningen av lagringsutrymme. Denna funktion kommer att bli tillgängliga på installationen av komprimeringsprogram "DivX".
- Manuellt justera kamerans läge så att hela kanyl kolon segment är synliga (med kanyle områden omedelbart intill de vertikala kanterna på videobilden) via fönstret videoinspelning programvara (se figur 1). I syfte att förbättra bildkvaliteten och minimera reflektioner, bifoga en papper / kartong sköld till kameran stöd för att blockera ströljus på organbadet. Optimera bildkvalitet genom att justera inställningarna för ljusstyrka, kontrast och exponering med kamerans programvara gränssnitt.
- Innan inspelningen ställa in en viss filnamn; i "Arkiv", välj "Set capture file" och ange ett unikt namn för videon.
- Börja spela in video genom att trycka på "Capture fil" från "Capture" verktygsfältet. För att stoppa recording välj "Stop capture" -knappen eller "Esc-tangenten på tangentbordet.
- Ersätta fysiologisk saltlösning som finns i inflödes reservoaren med färsk fysiologisk saltlösning var 30 min.
- Spela luminala tryck (se 2.9) och med hjälp av en temperatursond, ta del av organbadet temperatur. Upprepa dessa steg under hela experimentet (dvs. varje 30 min) för att säkerställa att dessa variabler är konstanta.
- Spela kolon aktivitet totalt för tre timmar (inklusive drogansökan och washout varaktighet). För datalagringsändamål, registrerar uppgifter i 15 min video segment. En fullständig experiment kommer typiskt att bestå av 12 x 15 min videoinspelningar.
- Rekord aktivitet för en timme under kontrollbetingelser (fysiologisk koksaltlösning).
- Applicera läkemedlet (antingen superfuseras in i badet eller administreras in i lumen via inflödesreservoaren) under 30 min till 1 h.
Obs: Olika administreringssätt kan yield olika effekter 23. - Applicera färsk fysiologisk saltlösning till badet eller lumen under en timme washout period.
4. databehandling och Generation Kartor över Spatiotemporal
- Process varje videoinspelning offline med hjälp av in-house mjukvara skriven i MATLAB (R2012a, version 7.4, tillgänglig på begäran) för att generera Spatiotemporal kartor som visar kolon motilitet.
- Öppen programvara för analys från ikonen på skrivbordet.
- I kommandofönstret skriver "Analyse2" för att öppna analyskontrollpanelen.
- Utnyttja kanten funktionen upptäckt att generera Spatiotemporal kartor genom att klicka på "Kantdetektion för AVI-filer" i kontrollpanelen fönstret. Denna funktion gör det möjligt för analysprogram att läsa recoded videoklipp i Audio Video Interleaved (AVI) format.
- Utför följande steg i tur och ordning för att generera Spatiotemporal kartor med hjälp av en ADAptive kantdetekteringsalgoritmen.
- Öppna inspelade videofiler genom att välja "Lägg till filer", välj "Öppna video" och välj platsen för videofiler.
- Från videofiler som anges i analysprogrammet, välj filen av intresse.
- Markera ett rektangulärt område av intresse inom ramen för videon, t ex hela längden av tjocktarmen, från den punkt vid vilken kolon kanyleras oralt till den anala kanylering. Säkerställa att de proximala och distala kanylepunkter är angränsande till de vertikala gränserna för regionen av intresse. Kantdetekteringslinjer (röd och grön) visas automatiskt ovanpå den realtidsbild.
- Säkerställa att kantdetekteringströskel linjer är omedelbart intill kolon på både de övre och undre gränserna för kolonvävnad (detta kan optimeras för varje video genom att förändra detektionströskelvärdena på kontrollpanelen). Se till att kanten upptäckt lines är kontinuerliga längs med längden av tjocktarmen bilden genom att justera kontrast och ljusstyrka med hjälp av kontrollpanelen.
- Komma in i hela längden av tjocktarmen (mm) i bredd dialogrutan (som noterats i steg 2,7). Välj sedan "Skapa värmekarta".
- I pop-up fönster, välj en plats för filen som ska sparas och ange ett filnamn för spatiotemporal kartan.
- Välj ".su2" format och välj "Lägg till i kön".
Obs: .su2 formatet komprimerar data till en mindre filstorlek och flera videofiler kan läggas till i kön. - Välj "Börja upptäckt" att generera Spatiotemporal kartor.
5. Analys av kartor Spatiotemporal
- Utnyttja Spatiotemporal kartor för att uppskatta parametrar såsom frekvens, utbredningshastighet, längd och varaktighet CMMCs, tarm diameter och punkten om inledande och riktning sammandragningar.
- Att börja analysera spatiotemporalkartor, typ "analyse2" i kommandofönstret som beskrivs i föregående avsnitt. I stället för "Edge upptäckt", välj "Heat karta analys" -knappen.
- Öppna Spatiotemporal kartfiler (.su2 filer) genom att välja fliken "Lägg till filer" och ange platsen för tidigare erhållna .su2 filer.
- När Spatiotemporal kartan syns på skärmen, ange en färgskala på kontrollpanelen, se till att minimi sätts till 1.
Notera att den maximala kan variera från 5 till 10 beroende på kontraktilitet av vävnaden. - Välj "Lås färgskalan" för att säkerställa alla kartor från ett enda experiment analyseras under samma förhållanden.
- Se till att raminställningar tid är konstant för alla Spatiotemporal kartor från ett givet experiment.
- För att bestämma CMMC frekvens, manuellt räkna sammandragningar som passerar igenom mer än 50% av längden av tjocktarmen. Dessa sammandragningar kan vara videoaseras som röd / orange ränder (standard HSV färgindex) på Spatiotemporal kartan (se figur 2 för ett exempel). Andra sammandragningar som är kortare eller inte propagerar kan också identifieras och kvantifieras.
- Om så önskas, genomföra ytterligare analys vid en högre upplösning av dessa kartor. Till exempel kan detaljerade egenskaper inklusive hastigheten och varaktigheten för varje sammandragning prövas.
- För att mäta hastigheten och varaktigheten, välj "Kommentera kontraktion vågor" -knappen på värmekartan analys kontrollpanel.
- Därefter zooma in varje CMMC genom att klicka på "Zoom" -knappen och välja området av intresse. Välj sedan "manuellt kommentera" för att kommentera varje sammandragning genom att använda musen för att dra en linje från den mest utgångsläge till slutet av varje sammandragning. Denna metod kan användas för att mäta den skenbara utbredningshastigheten och varaktigheten av utspädningar som visas att fortplanta (för t ex, se enal slutet av kartor i figur 2A, 2B).
Obs: Uppgifterna för hastighet och varaktighet kommer att visas under resultatfönstret. Dessa värden kan överföras till ett kalkylprogram av intresse genom att välja "Export data" -fliken. Oönskade kommentarer kan tas bort genom att klicka på "Ta bort markerade kommentarer" -knappen.
- Om så önskas, utnyttja x- och y-koordinaterna för de spatiotemporala kartor (tid och position längs kolon, respektive) för att bestämma positionen för insättande av små sammandragningar eller CMMCs.
- På liknande sätt, i syfte att bestämma intervallen mellan kontraktioner, använd "Anteckna" -funktion för att mäta varaktigheten mellan sammandragningar. Liksom tidigare kan dessa resultat exporteras till ett kalkylblad genom att välja "Export data" -fliken.
- För att mäta den vilande tarmen bredd, välj "Ta tvärsnitt" -knappen på värmekarta analyspanel.
- Välj "Lägg till9; på den temporala tvärsnitt panelen. Dubbelklicka på valfri plats i kartan för att generera en horisontell linje ovanpå värmekartan. uppgifter gut diameter kommer nu att visas i ett nytt fönster.
- För att mäta gut diameter, placera markören på en topp och intilliggande tråg för att erhålla genomsnittliga tarm bredd för en specifik experimentell tillstånd. Förändringar i tarmen diameter kan jämföras mellan experimentella förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Upp till 90% av patienter med ASD uppleva en array av gastrointestinala störningar, inkluderande diarré och förstoppning 18,24,25. Men de bakomliggande orsakerna till dessa gastrointestinala problem är okända. Många mutationer som identifierats i patienter med ASD är förknippade med synaptiska proteiner som bidrar till förändringar och störningar i synaptisk överföring eller funktion. En sådan mutation, i genen som kodar för celladhesionsmolekylen neuroligin-3 (NL3 R451C), identifierades i två bröder med ASD 17. Denna mutation resulterar i en argininrest vid position 451 i Neuroligin protein ersätts med en cystein. NL3 R451C möss som uttrycker denna mutation visar ökad GABA-medierad överföring i somatosensoriska cortex 16,26 tillsammans ökade AMPA och NMDA-receptorn förmedlad aktivitet inom hippocampus 25,27.
28-30. Som det enteriska nervsystemet spelar en viktig roll i regleringen av mag-tarmfunktion, postulerade vi att R451C mutationen skulle påverka rörligheten. Därför, för att undersöka eventuella förändringar i mag-tarmfunktioner på grund av synaptiska avvikelser vi försökt att undersöka effekterna av R451C mutation på CMMC frekvens i dessa möss.
Eftersom serotonin (5-HT) verkar på ENS att modulera gastrointestinal funktion hos möss 6 vi analyserat motilitet mönster som svar på 5-HT 3/4 receptorantagonist tropisetron i kolon preparat från WT och NL3 R451C möss.
För att bedöma om det synaptiska mutationen förändrar CMMCs när det enteriska nervsystemet är farmakologiskt störd, 5HT 3/4 receptorantagonisten Tropisetron (Trop;10 ^ M, som blockerar både 5HT3 och 5HT 4 receptorer) tillsattes till badet som innehåller kolon preparat (Figur 2). Kolonvävnad från nitton åldersmatchade hanmöss (11 WT och 8 NL3 R451C) användes. I närvaro av tropisetron, NL3 R451C möss visade en minskning i CMMC frekvens jämfört med WT kullsyskon. Representativa exempel på Spatiotemporal kartor som visar CMMCs och kontraktil aktivitet i WT- och NL3 R451C kolon beredningar visas i figurerna 2A till 2E respektive. Även om ingen skillnad observerades mellan WT och NL3 R451C under kontrollförhållanden, tropisetron signifikant minskade CMMC frekvens i både WT och NL3 R451C möss (Figur 2C, 2F). I WT möss, medianantalet CMMCs var 23 i kontrollförhållanden jämfört med 15 i tropisetron (p = 0,023). I NL3 möss, medianantalet CMMCs i kontrollvillkor var 19,5jämfört med 2 i närvaro av tropisetron (p = 0,022). Dessutom, tropisetron hade en större effekt på frekvensen av CMMCs i NL3 R451C möss jämfört med WT (p = 0,047).
Figur 1. organbad inrättat och generering av Spatiotemporal kartor. (A) En nyligen dissekeras gastrointestinal segment placeras i ett organbad (tvärsnittsvy) innehållande fysiologisk saltlösning och kanylerades vid orala och anala ändar. Den orala kanylen är ansluten till en inflödesreservoar fylld med fysiologisk saltlösning och den anal kanyl ansluten till en utflödesröret. En videokamera är placerad ovanför organbadet för att spela in kontraktil aktivitet i tjocktarmen. (B) rörlighet omvandlas till högupplösta Spatiotemporal kartor märknings regioner i tjocktarmen som är vidgade i blått och sammandragna regioner in röd. (C) En Spatiotemporal karta som visar kolon motilitet (CMMCs) från en vuxen WT mus. Individuella CMMCs anges som röda vertikala regioner inom kartan. X-axeln visar tiden ökande (0-15 min). Y-axeln representerar den rumsliga läge längs kolon segmentet (anal vid basen, oral överst). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Spatiotemporal kartor visar ökad känslighet för Tropisetron i NL3 R451C musändtarm Spatiotemporal kartor som visar CMMC frekvens i kolon segment från WT kontroller (A) och i närvaro av Tropisetron. (Trop, B). Trop minskade CMMC frekvens i WT kolon (C). Spatiote mporal kartor från NL3 kolon under kontrollbetingelser (D) och i närvaro av Trop (E). Trop orsakade en kraftig minskning i CMMC frekvens i NL3 kolon (F). CMMC frekvens som svar på Trop reducerades signifikant i NL3 jämfört med WT kolon (p = 0,047, ej visad). Gut bredd (pixel färg) anges på Y-axeln (godtyckliga enheter, intervall 1-6). Skala bar i E gäller för alla kartor. trop; Tropisetron. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schematisk av organbadet. (A) Ovanifrån, (B) undersida, (C) framifrån, (D) från sidan av en två kamrar organbad inrättas. Mått i mm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av den här videon bildteknik, var CMMC uppmätta frekvensen som en indikation på kolonrörlighet i vild typ och NL3 R451C möss, en musmodell av autism 17. Våra resultat tyder på en minskning av antalet CMMCs i mutanta NL3 R451C-möss jämfört med möss av vildtyp i närvaro av 5HT 3/4 receptorantagonisten Tropisetron antyder att NL3 R451C möss uppvisar en ökad känslighet för Tropisetron. Följaktligen föreslår vi att den neuroligin-3 R451C mutation förändrar serotonin-vägen, potentiellt genom att modulera antingen 5HT 3 eller 5HT 4-receptorfunktion i enteriska neuroner, slemhinnan eller båda. Detta belyser metodens värde för identifiering av fenotypiska skillnader mellan genotyper och för att identifiera specifika mål för senare studier.
Denna metod kan modifieras för att förbättra rumslig upplösning genom att förvärva videor viaen stereo-mikroskop utrustat med en kamera fäste. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för inspelningar som skall göras från små beredningar av mag-tarmkanalen vid embryonala tidpunkter så tidigt som E12.5 31. Neuromodulators kan appliceras via lumen eller i organbadet utanför kolon preparatet. Vidare är denna metod användbar för att bedöma både stora och små gastrointestinal motilitet i ett intervall av arter, inklusive möss, råttor och marsvin.
Vanliga felsökningssteg för denna metod innefattar att kontrollera flödet av lösningen via slangar, livskraft vävnadspreparat, underhåll av konstant luminala tryck och se till att kolon segment ligger bort från väggarna i organbadet. Blockeringar i slangen kan ändra luminala tryck och förhindra sammandragningar inträffar; därför alla rör måste rengöras noggrant för att avlägsna saltkristaller eller skräp / avföring före kanyle. Luft måste tas bort från slangledningar direkt samband med kanylen före experiment (dvs genom priming rören med saltlösning). Dessutom måste vävnadspreparat hanteras varsamt för att förhindra skador till följd av orörlighet i tjocktarmen. För att undvika vävnadsskada, se till att kolon är fast (men inte tätt) fäst till kanylen under inspelningsprocessen och hålla en konstant temperatur och en kontinuerlig tillförsel av CO 2 + O 2 till badet. Se också till att den luminala trycket hålls konstant och att inga sammandragningar initieras manuellt genom att justera inflödes reservoarer under registreringsperioden. Säkerställa att kolonvävnad inte kommer i kontakt med väggen i organbadet under värkarna, eftersom detta kommer att förhindra kantdetekteringsanalys av de relevanta Spatiotemporal kartor. Detta kan undvikas genom att övervaka kontraktionerna under jämviktsperioden och justering av läget av tjocktarmen för att förhindra att detta inträffar under experimentet.
_content "> Flera begränsningar förknippade med denna teknik bör tas i beaktande när man analyserar och tolkar data, inklusive den låga genomströmningen natur detta tillvägagångssätt. Medan metoden är effektiv för att identifiera förändringar i migrera motor mönster, kan det inte avgöra om utspädningar som inträffar under utvecklingen av en CMMC är neuralt medierad eller helt enkelt passiva svar på den kontraktila aktiviteten (dvs, till följd av förflyttning av vätska). de koncentrationsgradienter för diffusion över kolonväggen tillåter effekterna av luminally applicerade läkemedel tillskrivas åtgärder inom slemhinnan, men i långa experiment mucosal degeneration kan ske därigenom förändra platserna för verkan av dessa läkemedel under inspelningsperioden. Vidare om droger har tydliga effekter i myenteric och submukosala plexus kan inte fastställas med denna metod. däremot kan detta tillvägagångssätt en kollektiv utvärdering av effekterna på den enter nervous systemet genom att mäta en total förändring i motilitet mönster. Ytterligare överväganden inkluderar behovet av att ta hänsyn till vilken typ av data (dvs räkna uppgifter för CMMC frekvens, som kräver icke-parametrisk analys) och den låga frekvensen av CMMCs, när man utformar experiment och lämpliga strategier för dataanalys.Nyligen Barnes och kollegor föreslog att kolonvävnad kräver stimulering för att observera CMMCs 32, men publicerade resultaten från vårt labb visar att spontana CMMCs kan observeras genom att helt enkelt sätter vävnaden till organbadet via tarmkäxet 7. Förekomsten av CMMCs under dessa betingelser visar inte bara spontanitet CMMCs, men vidare bearbetar nyttan av denna teknik för att fastställa förändringar i kolon motilitet. Även om detta tillvägagångssätt är tillämpbart på extra-kolon regioner av mag-tarmkanalen, komplexiteten i små intestinal motilitet kräver mer Detailed analys strategier än de som används för att kvantifiera CMMCs 33.
Denna experimentella metod har mycket hög rumslig och tidsmässig upplösning och inkluderar möjligheten att läkemedelstillförsel både externt i förhållande till och inuti lumenen för att undersöka effekterna av varierande koncentrationsgradienter på det enteriska nervsystemet. Dessutom är denna metod lämplig för att analysera tunntarmssegmente under födointag 6,23. Ex vivo karaktären av denna metod möjliggör roll enteriska nervsystemet som ska bedömas i avsaknad av centrala nervsystemet ingångar och är därför ett idealiskt sätt att undersöka gastrointestinal motilitet i en mängd olika modeller, inklusive genetiska modeller av sjukdomen (se figur 2) 6,34.
Denna metod kan också användas för att jämföra fysiologiska data till datorsimuleringar av motorisk aktivitet 23,33,35. Sådana simuleringar kan förutsäga motormönsteri form av Spatiotemporal kartor för direkta jämförelser med fysiologiska experiment 33,35. Med användande av Fast Fourier Transform och wavelet-analys 36, kan också extraheras bidraget av glatta muskelceller pacemakers (som genereras av interstitiella celler av Cajal) till motilitet. Dessutom kan den här videon avbildningsteknik kombineras med extracellulära inspelning av elektrisk aktivitet i muskeln 3 för att tillåta bidrag neurala och myogena mönsterritare att särskilja. Notera, den extracellulära registreringsmetod löser inhibitoriska kopplingspotentialer i frånvaro av kontraktioner av glatt muskulatur eller relaxationer.
Även om denna teknik är väl etablerad för analys av gastrointestinal motilitet i ett brett spektrum av beredningar och arter, det har också potential att användas i andra system, såsom studier av kärlsammandragning i tarmkäxet (tidigare analyserades via en enklare diameter tracking system 37) ochi skelettmuskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JCB och ELH-Y stöddes av US Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) till ELH-Y.The May Stewart stipendie-University of Melbourne förtroende finansierade stipendium till MS. Vi tackar Ali Taher, Fátima Ramalhosa och Gracia Seger för tekniska insatser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
- Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M.
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
