Summary

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em> Coxiella burnetii</em

Published: April 18, 2016
doi:

Summary

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Abstract

Coxiella burnetii, der Agent Q – Fieber verursacht, ist ein obligat intrazelluläres Bakterium. PCR – basierten diagnostischen Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinischen Proben. PCR erfordert spezielle Ausrüstung und umfassende Schulung von Endanwendern, und daher ist es für Routinearbeiten vor allem in einem ressourcenbeschränkte Bereich nicht geeignet. Wir haben eine loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) Assay entwickelt , um die Anwesenheit von C. nachzuweisen burnetii in Patientenproben. Dieses Verfahren wird bei einer einzigen Temperatur etwa 60 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses LAMP-Test ist sehr ähnlich wie PCR mit einer Nachweisgrenze von etwa 25 Kopien pro Reaktion. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung der Reaktion lyophilisierten Reagenzien und Visualisierung der Ergebnisse mit hydroxynaphthol blau (HNB) oder einer UV-Lampe mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion verwendet wird. Die LAMP-Reagenzien waren lyophilized und bei Raumtemperatur (RT) einen Monat lang ohne Verlust der Detektionsempfindlichkeit gespeichert. Diese LAMP-Test ist besonders robust, da die Reaktionsgemischaufbereitung nicht komplexe Schritte beinhaltet. Diese Methode ist ideal für den Einsatz in begrenzten Ressource-Einstellungen, wo Q-Fieber endemisch ist.

Introduction

Die kleine Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii ist der Erreger des Q – Fiebers, das ein weltweit Zoonose ist. Durch den weltweiten Vertrieb von Q – Fieber und die hohe Infektiosität von C. burnetii, US – Militär- und Zivilpersonal im Ausland im Einsatz sind in Gefahr, in den Endemiegebieten infiziert.

Q-Fieber manifestiert sich in zwei Formen: akute und chronische Infektionen. Akute Q-Fieber präsentiert sich mit grippeähnlichen Symptomen, Hepatitis oder Pneumonie, und ist in der Regel eine selbstlimitierend Krankheit mit einer niedrigen Sterblichkeit. Chronische Q-Fieber, während weniger verbreitet, führt oft zu Endokarditis, die eine viel höhere Mortalitätsrate hat , wenn 1,2 unbehandelt. Daher ist eine frühzeitige Diagnose führen eine geeignete Behandlung für die Patientenversorgung kritisch ist. Polymerase – Kettenreaktion (PCR) und quantitative Echtzeit – PCR (qPCR) Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinische Proben 3-5 </ Sup>. Beide PCR und qPCR sind teuer und oft nicht ohne weiteres verfügbar in ressourcenbeschränkte Bereiche für die Routinearbeit.

Ursprünglich von Notomi 6 beschrieben, Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) bietet eine alternative DNA – Verstärkungsverfahren. LAMP verwendet Bst DNA – Polymerase zusammen mit speziell entwickelten Primer – Sets Verschiebung DNA Synthese Strang, der mindestens sechs unabhängigen Regionen des Zielgens zu erkennen. Der signifikanteste Vorteil ist, dass LAMP-Amplifikation unter isothermischen Bedingungen auftritt. Daher ist nur ein Wasserbad, Heizblock oder ein Inkubator ist nicht erforderlich. Dieses Verfahren wurde verwendet 7-9 verschiedene rickettsial Pathogene zu erkennen. Visualisierung von amplifizierte DNA-Produkte durch Gelelektrophorese ist die genaueste Methode, die wahren Positiven von Fehlalarme aufgrund unspezifischer Amplifikation unterscheiden kann. Jedoch sind die in der Gelelektrophorese angewandten Verfahren nicht praktikabel für begrenzten Ressource-areas. Es wurden verschiedene alternative Verfahren entwickelt, um die Reaktionsprodukte zu detektieren. Diese alternativen, wie Trübung , abgeleitet von Magnesiumpyrophosphat Formation 10 oder unter Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff unter UV – Licht visualisiert werden 11,12 sind günstiger als ein Gel läuft. Die LAMP – Reagenzien waren einen Monat lang stabil , wenn sie bei 25 ° C und 37 ° C gelagert, die sind Umgebungstemperaturen in tropischen und subtropischen Ländern , in denen Q – Fieber endemisch 13 ist.

Ein LAMP – Assay wurde in unserem Labor entwickelt , um das Vorhandensein von C. zu erkennen burnetii in Plasmaproben 14. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Herstellung der LAMP Reaktionsmischung aus dem lyophilisierten Reagenzien. Die lyophilisierten Reagenzien sind stabil für einen Monat, wenn bei RT gelagert. Wenn sie mit einem einfachen Visualisierungsverfahren kombiniert werden , ist dies eine ideale Methode zum Nachweis C. verwenden burnetii in einer begrenzten Ressource-Einstellung.

Protocol

1. Bereiten Sie Plasmid-DNA Verdünnungen als Standard für den LAMP-Reaktion Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte (OD) bei 260 nm zu messen , um das Plasmid (enthaltend Zielgen IS1111a von C. burnetii RSA 493) DNA – Konzentration zu bestimmen. Eine OD 260 von 1 entspricht 50 ug / ul DNA. Konvertieren Sie die Menge von Plasmid-DNA in die Kopienzahl. Da die Größe des Plasmids 6330 bp ist, ist das Molekulargewicht dieses Plasmids 4,1 x 10 6 g…

Representative Results

Die lyophilisierten LAMP Reagenzien innerhalb der 0,2 – ml – Röhrchen enthält Bst DNA – Polymerase, Primer und dNTPs. 20 ul Rekonstitution Puffer wird verwendet , die lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. Abbildung 1 zeigt die LAMP Reaktion führt auf Agarosegelen mit frisch zubereiteten Reagenzien und gefriergetrocknet Reagenzien. Das gefriergetrocknete Reagenz verringert nicht seine Aktivität. LAMP Reaktionen von beiden Reagenzien hergestellt w…

Discussion

Bisher haben wir eine empfindliche und spezifische LAMP – Targeting – Assay das Einsatzelement IS1111a 14. Das IS1111 Element wurde ausgewählt , weil es stark unter den verschiedenen Stämmen von C. konserviert burnetii und die hohe Anzahl der Kopien (7-110) in den Bakterien (Klee 2006). Unsere Ergebnisse zeigten , dass LAMP können etwa 25 Kopien des IS1111 Element erkennen, die so wenig wie eine chromosomale Kopie von Coxiella DNA korrelieren. In dieser…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von Naval Medical Research Center, Forschung Arbeitseinheit 6000.RAD1.J.A0310 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und geben nicht unbedingt die offizielle Politik oder Position des Department of the Navy, Department of Defense, oder der US-Regierung widerspiegeln. Wei-Mei Ching ist ein Mitarbeiter der US-Regierung. Diese Arbeit wurde im Rahmen ihrer offiziellen Aufgaben vorbereitet. Titel 17 USC § 105 heißt es: "Der Urheberrechtsschutz unter diesem Titel für jede Arbeit der Regierung der Vereinigten Staaten nicht zur Verfügung steht." Titel 17 USC §101 definiert eine US-Regierung Arbeit als Arbeit, die durch Militärdienst Mitglied oder Mitarbeiter der US-Regierung als Teil der Person durch Amtspflichten.

Materials

LAMP primers Eurofins MWG operon 10 nmol, salt free Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase New England Biolabs M0275L 8 units/ml
10X Thermo pol buffer New England Biolabs B9004S
dNTP mixture New England Biolabs N0447L 10 mM each
Betaine Sigma-Aldrich B0300 5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M3409-1ML 1 M
10X Bluejuice Invitrogen 10816-015 gel loading buffer
SYBR green Invitrogen S7585 10,000X, visualize products in tubes
GelRed Phenix Research Products RGB-4103 10,000X, visualize products in gels
Lyophilized reagents Gene Reach
Hydroxynaphthol blue Fluka 33936-10G
ESEQuant tube scanner Qiagen real-time detection

References

  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Play Video

Cite This Article
Chen, H., Ching, W. The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii. J. Vis. Exp. (110), e53839, doi:10.3791/53839 (2016).

View Video