تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em> الكوكسيلا البورنيتية</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
الكوكسيلا البورنيتية، وكيل يسبب حمى Q، هو البكتيريا داخل الخلايا إلزام. وقد وضعت PCR المقايسات التشخيص للكشف عن C. الحمض النووي البورنيتية في مزارع الخلايا والعينات السريرية. PCR يتطلب معدات متخصصة وتدريب المستخدمين واسعة نهاية، وبالتالي، فإنه ليس مناسبة للعمل الروتيني وخصوصا في منطقة محدودة الموارد. لقد قمنا بتطوير فحص بوساطة حلقة متساوي الحرارة التضخيم (LAMP) للكشف عن وجود C. البورنيتية في عينات من المرضى. يتم تنفيذ هذه الطريقة في درجة حرارة واحدة نحو 60 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة التدفئة. حساسية هذا الاختبار LAMP هي مشابهة جدا لPCR مع حد الكشف عن حوالي 25 نسخة في رد الفعل. ويصف هذا التقرير إعداد رد فعل باستخدام الكواشف مجفف بالتجميد وتصور النتائج باستخدام اللون الأزرق hydroxynaphthol (HNB) أو مصباح الأشعة فوق البنفسجية مع صبغة الإقحام الفلورسنت في رد الفعل. كانت الكواشف LAMP lyophiliزيد وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة شهر واحد دون فقدان للحساسية الكشف. هذا الاختبار مصباح قوي بشكل خاص لإعداد خليط التفاعل لا ينطوي على خطوات معقدة. هذه الطريقة مثالية للاستخدام في المناطق ذات الموارد المحدودة حيث حمى Q متوطن.
Introduction
وسلبية الغرام بكتيريا صغيرة الكوكسيلا البورنيتية هو العامل المسبب للحمى Q، وهو مرض حيواني المصدر في جميع أنحاء العالم. نظرا للتوزيع في جميع أنحاء العالم س حمى في والعدوى عالية من C. البورنيتية والموظفين العسكريين والمدنيين الأمريكيين المنتشرين في الخارج معرضون لخطر الإصابة بالعدوى في المناطق الموبوءة.
يظهر حمى Q في شكلين: الالتهابات الحادة والمزمنة. يعرض الحاد Q-حمى نفسه من أعراض تشبه أعراض الأنفلونزا، والتهاب الكبد، أو الالتهاب الرئوي، وعادة ما يكون المرض الذاتي الحد مع معدل وفيات منخفض. المزمنة حمى Q، في حين أن أقل انتشارا، وغالبا ما يؤدي إلى التهاب الشغاف، والتي لديها معدل وفيات أعلى من ذلك بكثير إذا تركت دون علاج 1،2. لذلك فإن التشخيص المبكر لتوجيه العلاج المناسب هو أمر حاسم لرعاية المرضى. وقد وضعت تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي الكمي PCR (QPCR) فحوصات للكشف عن C. الحمض النووي البورنيتية في مزارع الخلايا وعينات سريرية 3-5 </ سوب>. كلا PCR وQPCR مكلفة وغالبا ما تكون غير متاحة بسهولة في المناطق ذات الموارد المحدودة للعمل الروتيني.
وصف الأصلية كتبت بواسطة Notomi 6، بوساطة حلقة التضخيم متساوي الحرارة (LAMP) يوفر طريقة الحمض النووي التضخيم بديل. يستخدم مصباح البلمرة بتوقيت جرينتش الحمض النووي حبلا النزوح توليف الحمض النووي جنبا إلى جنب مع مجموعات التمهيدي مصممة خصيصا تعترف لا يقل عن ستة أقاليم مستقلة عن الجينات المستهدفة. أهم ميزة من مصباح هو أن التضخيم يحدث في ظل ظروف متساوي الحرارة. لذلك، فقط مطلوب حمام مائي، كتلة التدفئة أو حاضنة. وقد استخدمت هذه الطريقة للكشف عن عدة مسببات الأمراض ريكيتسي 7-9. التصور منتجات تضخيم الحمض النووي من قبل الكهربائي للهلام هو الأسلوب الأكثر دقة التي يمكن أن تفرق ايجابيات الحقيقية من ايجابيات كاذبة بسبب التضخيم غير محددة. ومع ذلك الإجراءات المتعلقة الكهربائي للهلام ليست عملية لع ذات الموارد المحدودةقمة شرق آسيا. وقد وضعت عدة طرق بديلة للكشف عن منتجات التفاعل. هذه البدائل، مثل تعكر المستمدة من تشكيل بيروفوسفات المغنيسيوم 10 أو باستخدام صبغة الفلورسنت الإقحام أن تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 11،12 هم أكثر ملاءمة من تشغيل هلام. كانت الكواشف LAMP مستقرة لمدة شهر واحد عند تخزينها في درجة حرارة 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية، وهي درجة حرارة الجو المحيط في البلدان الاستوائية وشبه الاستوائية حيث حمى Q متوطن 13.
وقد تم تطوير فحص مصباح في مختبرنا للكشف عن وجود C. البورنيتية في عينات البلازما 14. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لإعداد خليط التفاعل مصباح من الكواشف مجفف بالتجميد. الكواشف مجفف بالتجميد مستقرة لمدة شهر واحد عند تخزينها في RT. عندما جنبا إلى جنب مع وسيلة سهلة التصور، وهذا هو الأسلوب الأمثل لاستخدام للكشف عن C. البورنيتية في إعداد محدودة الموارد.
Protocol
Representative Results
Discussion
سابقا، وضعنا حساس ونوعي مصباح فحص استهداف عنصر الإدراج IS1111a 14. وقد تم اختيار العنصر IS1111 لأنه حفظها للغاية بين سلالات مختلفة من C. البورنيتية ورقمه عالية النسخ (7-110) في البكتيريا (كلي 2006). وأظهرت النتائج التي توصلنا إليها مصباح يمكن الكشف عن 25 نسخة من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مركز البحوث الطبية البحرية، والبحوث وحدة العمل 6000.RAD1.J.A0310. الآراء الواردة في هذا المقال هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة السياسة الرسمية أو موقف وزارة البحرية، وزارة الدفاع، أو الحكومة الأمريكية. وي مي تشينغ هو موظف في حكومة الولايات المتحدة. وقد أعد هذا العمل كجزء من مهامها الرسمية. يوفر عنوان 17 USC §105 أن "حماية حق المؤلف تحت هذا العنوان لا تتوفر في أي عمل من حكومة الولايات المتحدة." العنوان 17 USC §101 يحدد عمل حكومة الولايات المتحدة كما عمل من قبل عضو في الجيش أو موظف في حكومة الولايات المتحدة إعدادها كجزء من الواجبات الرسمية لذلك الشخص.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
