冻干环介导等温扩增试剂的检测中的发展<em>贝氏柯克斯体</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
贝氏柯克斯体 ，引起Q热剂，是一种专性细胞内细菌。基于PCR的诊断测定法已经开发了用于检测C.在细胞培养物和临床样品burnetii的DNA。 PCR需要专门的设备和大量的最终用户培训，因此，它不适合用于特别是在资源有限的地区的日常工作。我们已经开发出一种环介导等温扩增（LAMP）法检测C的存在burnetii患者样品英寸该方法是在在水浴或加热块约60℃的单一温度下进行。此LAMP检测的灵敏度非常相似的PCR用的每个反应约25拷贝的检测限。本报告描述了使用冷冻干燥的试剂和使用hydroxynaphthol蓝色（HNB）或在反应的荧光嵌入染料UV灯结果的可视化的反应的制备方法。该LAMP试剂均为lyophili捷思并储存于室温（RT）一个月没有检测灵敏度的损失。因为反应混合配制不涉及复杂的步骤，这LAMP检测尤为强劲。这种方法非常适合在资源有限的环境中使用，其中Q热流行。
Introduction
小革兰氏阴性细菌贝氏柯克斯体是Q热，这是一个世界性的动物传染病的病原体。由于Q热的全球分销和C.高传染性burnetii，海外部署的美国军事人员和文职人员都在被感染的流行地区的风险。
Q热表现为两种形式：急性和慢性感染。急性C-发热呈现本身具有类似流感的症状，肝炎，或肺炎，通常是一种自限性疾病与低死亡率。慢性C-发热，而不太普遍，通常导致心内膜炎，如果不治疗的1,2-其具有高得多的死亡率。因此，早期诊断，指导适当的治疗为病人护理的关键。聚合酶链反应（PCR）和定量实时PCR（qPCR的）测定法已经开发了用于检测C.在细胞培养和临床标本3-5 <burnetii DNA/ SUP>。 PCR和定量PCR是昂贵的，往往不是在日常工作资源受限的地区一应俱全。
最初由Notomi 6中所述，环介导等温扩增（LAMP）提供了一种替代DNA扩增方法。灯使用为链置换DNA合成的Bst DNA聚合酶与识别靶基因的至少六个独立区域专门设计的引物组沿。灯的最显著优点是，在等温条件下发生扩增。因此，只需要一个水浴，加热块或培养箱。此方法已被用于检测多种立克次氏体的病原体7-9。通过凝胶电泳的扩增DNA产物的可视化是可区分假阳性真阳性由于非特异性扩增的最精确的方法。然而涉及凝胶电泳的程序不用于资源有限的芳实际EAS。被开发几种可供选择的方法来检测反应产物。这些替代方案中，如从焦磷酸镁的形成10或使用荧光嵌入染料衍生的浊度在紫外灯下11,12被可视化比运行凝胶更为有利。当储存在25℃和37℃，这是在热带和亚热带国家的环境温度，其中Q热流行13上的LAMP试剂为一个月稳定。
一盏灯试验在我们的实验室开发的检测C.存在burnetii血浆样品14英寸在这里，我们描述了从冻干试剂的制备上的LAMP反应混合物的一个简单的协议。当储存在室温冻干试剂是一个月稳定。当与方便的可视化相结合的方法，这就是使用检测C.一种理想的方法burnetii在资源有限的设置。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前，我们开发了一个敏感和特异LAMP检测针对插入元素IS1111a 14。被选择的IS1111元件，因为它是高度C的不同菌株中保守burnetii和细菌高份数（7〜110）（2006年克利）。我们的结果表明，灯可以检测约25 IS1111元件，其可以关联到贝氏的DNA少则一染色体拷贝的拷贝。在这项研究中， 的Bst DNA聚合酶，LAMP引物和dNTP冻干并包装在压缩铝箔袋。这些冻干…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是由海军医学研究中心，科研单位6000.RAD1.J.A0310支持。在这篇文章中表达的观点是作者的，并不一定反映海军，国防部或美国政府部门的官方政策或立场。伟美程是美国政府雇员。这项工作准备为她的公务上。标题17 USC§105规定，“这个标题下版权保护不适用于美国政府的任何工作。”标题17 USC§101定义为军事服务成员或美国政府雇员制是那个人的官方职责的一部分工作美国政府的工作。
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
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