Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, l'agent responsable de la fièvre Q, est une bactérie intracellulaire obligatoire. Des dosages diagnostiques basées sur la PCR ont été développées pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures de cellules et d' échantillons cliniques. PCR nécessite un équipement spécialisé et une formation approfondie de l'utilisateur final, et par conséquent, il ne convient pas pour le travail de routine en particulier dans une zone de ressources limitées. Nous avons mis au point une boucle à médiation par une amplification isotherme (LAMP) essai pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de patients. Ce procédé est effectué à une seule température d'environ 60 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant. La sensibilité de ce dosage de la lampe est très similaire à la PCR avec une limite de détection d'environ 25 copies par réaction. Ce rapport décrit la préparation de la réaction en utilisant des réactifs lyophilisés et la visualisation des résultats en utilisant le bleu hydroxynaphthol (HNB) ou une lampe UV avec colorant fluorescent intercalant dans la réaction. Les réactifs LAMP étaient lyophilized et conservé à température ambiante (TA) pendant un mois, sans perte de sensibilité de détection. Ce test LAMP est particulièrement robuste car la préparation du mélange réactionnel ne comporte pas d'étapes complexes. Cette méthode est idéale pour une utilisation dans des environnements à ressources limitées où la fièvre Q est endémique.
Introduction
Le petit Gram négatif bactérie Coxiella burnetii est l'agent causal de la fièvre Q, qui est une zoonose dans le monde entier. En raison de la distribution mondiale de la fièvre Q et la forte infectivité de C. burnetii, les militaires et les civils américains déployés à l' étranger sont à risque d'être infectés dans les zones endémiques.
La fièvre Q se manifeste sous deux formes: les infections aiguës et chroniques. La fièvre Q aiguë se présente avec des symptômes semblables à la grippe, l'hépatite, ou la pneumonie, et est habituellement une maladie auto-limitation avec un faible taux de mortalité. La fièvre Q chronique, alors que moins répandue, se traduit souvent par une endocardite, qui a un taux de mortalité beaucoup plus élevé si non traitée 1,2. Par conséquent, le diagnostic précoce pour guider un traitement approprié est essentiel pour les soins aux patients. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) et en temps réel de PCR quantitative (qPCR) essais ont été développés pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures cellulaires et des échantillons cliniques 3-5 </ Sup>. Les deux PCR et qPCR sont coûteuses et souvent pas facilement disponibles dans les zones de ressources limitées pour le travail de routine.
Initialement décrit par Notomi 6, isothermes amplification de boucle médiée (LAMP) offre une méthode d'amplification d' ADN alternative. Lampe utilise l' ADN polymerase Bst pour la synthèse d'ADN par déplacement de brin ainsi que des ensembles d' amorces spécialement conçues qui reconnaissent au moins six régions indépendantes du gène cible. L'avantage le plus important de lampes est que l'amplification se produit dans des conditions isothermes. Par conséquent, seul un bain d'eau, bloc chauffant ou un incubateur est nécessaire. Cette méthode a été utilisée pour détecter plusieurs pathogènes rickettsies 7-9. La visualisation des produits d'ADN amplifiés par électrophorèse sur gel est la méthode la plus précise qui permet de différencier les vrais positifs de faux positifs dus à une amplification non spécifique. Toutefois, les procédures impliquées dans l'électrophorèse sur gel ne sont pas pratiques pour les ar des ressources limitéeseas. Plusieurs méthodes ont été développées pour détecter les produits de la réaction. Ces alternatives, telles que la turbidité dérivée de la formation de pyrophosphate de magnésium 10 ou à l' aide d' un colorant fluorescent intercalant pour être visualisé sous lumière UV 11,12 sont plus favorables que l' exécution d' un gel. Les réactifs LAMP ont été stables pendant un mois lorsqu'il est conservé à 25 ° C et 37 ° C, qui sont des températures ambiantes dans les pays tropicaux et sub-tropicales où la fièvre Q est endémique 13.
Un essai de lampe a été développé dans notre laboratoire pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de plasma 14. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation du mélange réactionnel de lampe à partir des réactifs lyophilisés. Les réactifs lyophilisés sont stables pendant un mois lorsqu'il est conservé à température ambiante. Lorsqu'il est combiné avec une méthode de visualisation facile, ceci est une méthode idéale à utiliser pour détecter C. burnetii dans un cadre de ressources limitées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auparavant, nous avons développé un test LAMP sensible et spécifique ciblant l'élément d'insertion IS1111a 14. L'élément IS1111 a été choisi parce qu'il est hautement conservée entre les différentes souches de C. burnetii et son nombre élevé de copies (7-110) dans les bactéries (Klee 2006). Nos résultats ont montré que la lampe peut détecter environ 25 copies de l'élément IS1111, qui peut en corrélation avec aussi peu que une copie ch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par Naval Medical Research Center, unité de recherche de travail 6000.RAD1.J.A0310. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement la politique ou la position officielle du ministère de la Marine, Département de la Défense, ou le gouvernement des États-Unis. Wei-Mei Ching est un employé du gouvernement des États-Unis. Ce travail a été préparé dans le cadre de ses fonctions officielles. Titre 17 USC §105 prévoit que «la protection des droits d'auteur sous ce titre ne sont pas disponibles pour tous les travaux du gouvernement des États-Unis.» Titre 17 USC §101 définit un travail du gouvernement des États-Unis comme un travail préparé par un membre du service militaire ou employé du gouvernement américain dans le cadre de fonctions officielles de cette personne.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
