の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em> Q熱リケッチア</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Q熱リケッチア 、Q熱を引き起こす因子は、偏性細胞内細菌です。 PCRに基づく診断アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床試料中バーネッティ DNA。 PCRは、特殊な装置や大規模なエンドユーザのトレーニングを必要とし、したがって、それは、特に、リソースに制約のある領域にルーチン作業には適していません。我々は、Cの存在を検出するためのループ媒介等温増幅（LAMP）アッセイを開発しました患者サンプル中バーネッティ 。この方法は、水浴または加熱ブロック中60℃付近の単一の温度で行われます。このLAMPアッセイの感度は、反応当たり約25コピーの検出限界を用いたPCRに非常に類似しています。このレポートでは、凍結乾燥試薬およびhydroxynaphtholブルー（HNB）または反応中の蛍光挿入色素とUVランプを使用して結果の可視化を用いて反応の調製を記載します。 LAMP試薬はlyophiliました検出感度を損なうことなくZED 1ヶ月室温（RT）で保存しました。反応混合物の調製は、複雑な工程を必要としないので、このLAMPアッセイは、特に頑強です。この方法は、Q熱が流行しているリソースが制限された設定での使用に最適です。
Introduction
小さ いグラム陰性菌コクシエラバーネッティは、世界中の人獣共通感染症であり、Q熱の原因物質です。 Q熱の世界的な分布とCの高い感染へ海外展開バーネッティ 、米軍と文民要員が流行地域に感染しているの危険にさらされています。
急性および慢性の感染症：Q熱は、2つの形で現れます。急性Q熱は、インフルエンザ様症状、肝炎、または肺炎で自身を提示し、通常、低い死亡率と自己制限疾患です。慢性Q熱は、あまり普及しているが、多くの場合、1,2-放置すれば、はるかに高い死亡率を有している心内膜炎、になります。したがって、適切な治療を導くために早期診断は患者のケアのために重要です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および定量的リアルタイムPCR（定量PCR）アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床サンプル3-5 <中バーネッティ DNA/ SUP>。 PCRおよび定量PCRの両方がルーチンワークのリソースに制約のある地域でのコストがかかり、多くの場合、容易に入手できません。
もともと納富6で説明した、LAMP法（LAMP）は、代替のDNA増幅法を提供しています。 LAMPは、標的遺伝子の少なくとも6つの独立した領域を認識する特別に設計されたプライマーセットと共に、鎖置換型DNA合成のためのBst DNAポリメラーゼを使用します。 LAMPの最も重要な利点は、増幅が等温条件下で起こることです。したがって、唯一の水浴、加熱ブロックまたはインキュベータが必要です。この方法は、いくつかのリケッチア病原体7-9を検出するために使用されてきました。ゲル電気泳動により増幅されたDNA産物の可視化は、非特異的な増幅に起因する偽陽性から真陽性を区別することができる最も正確な方法です。しかし、ゲル電気泳動に関わる手順は、リソースが制限されたARのための実用的ではありませんEAS。いくつかの代替方法は、反応生成物を検出するために開発されました。このようなピロリン酸マグネシウムの形成10またはUV光11,12の下で可視化する蛍光挿入色素を使用してから派生した濁度としてこれらの代替は、ゲルを実行するよりも有利で す。 Q熱が流行し13である熱帯および亜熱帯の国では、周囲温度である25℃、37℃、で保存した場合LAMP試薬は、1ヶ月間安定でした。
LAMPアッセイはCの存在を検出するために我々の研究室で開発されました血漿試料中のバーネッティ 14。ここでは、凍結乾燥試薬からLAMP反応液を調製するためのシンプルなプロトコルを記述します。室温で保存した場合、凍結乾燥試薬は、1ヶ月間安定です。簡単に可視化手法と組み合わせると、これはCを検出するために使用するのに理想的な方法であり、リソース制限の設定においてバーネッティ 。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前、我々は、挿入要素IS1111a 14をターゲットに高感度で特異的なLAMPアッセイを開発しました。それは非常にC.の異なる株の間で保存されているため、IS1111要素が選択されましたバーネッティと細菌中のコピーのその高い番号（110から7）（クレー2006）。我々の結果は、LAMPはコクシエラ DNAのわずか1染色体コピーに相関し得るIS1111要素の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米海軍医学研究センター、研究作業単位6000.RAD1.J.A0310によってサポートされていました。この記事で表明された見解は執筆者のものであり、必ずしも海軍省、国防省、または米国政府の公式な政策や位置を反映するものではありません。魏メイチンは、米国政府の従業員です。この作品は彼女の公務の一部として用意しました。タイトル17 USC§105」このタイトルの下に著作権保護は、米国政府のいずれかの作業には使用できません。」ことを提供しますタイトル17 USC§101は、その人の公務の一環として、米国政府の兵役のメンバーや従業員によって調製作品として米国政府の仕事を定義します。
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
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