Utvikling av lyofilisert Loop-mediert Isotermiske amplifiseringsreagenser for deteksjon av<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, agenten forårsaker Q-feber er en obligat intracellulær bakterie. PCR-baserte diagnostiske analyser er blitt utviklet for påvisning av C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver. PCR krever spesialisert utstyr og omfattende opplæring av sluttbruker, og derfor er det ikke egnet for rutinearbeid, spesielt i en ressurs med begrenset område. Vi har utviklet en sløyfe-mediert isoterm amplifisering (lampe) assay for å påvise nærværet av C. burnetii i pasientprøver. Denne fremgangsmåten utføres ved en enkelt temperatur rundt 60 ° C i et vannbad eller varmeblokk. Følsomheten av denne lampen analysen er svært lik PCR med en deteksjonsgrense på ca. 25 kopier pr reaksjon. Denne rapporten beskriver fremstillingen av reaksjonen ved bruk av lyofiliserte reagenser og visualisering av resultater ved hjelp av hydroxynaphthol blå (HNB) eller en UV-lampe med fluorescerende interkalerende fargestoff i reaksjonen. LAMP reagenser var lyophilized og lagret ved romtemperatur (RT) i en måned uten tap av følsomhet. Dette LAMP analysen er spesielt robust fordi reaksjonsblandingen preparatet ikke involverer kompliserte trinn. Denne metoden er ideell for bruk i ressursbegrensede miljøer hvor Q-feber er endemisk.
Introduction
Den lille Gram-negative bakterien Coxiella burnetii er den utløsende agent for Q-feber, som er et verdensomspennende zoonose. På grunn av Q-feber verdensomspennende distribusjon og høy smittsomhet av C. burnetii, amerikanske militære og sivilt personell utplassert i utlandet står i fare for å bli smittet i endemiske områder.
Q-feber manifesterer seg i to former: akutte og kroniske infeksjoner. Akutt Q-feber presenterer seg med influensalignende symptomer, hepatitt eller lungebetennelse, og er vanligvis en selvbegrensende sykdom med lav dødelighet. Kronisk Q-feber, mens mindre utbredt, ofte resulterer i endokarditt, som har en mye høyere dødelighet hvis venstre ubehandlet 1,2. Derfor, for å tidlig diagnose lede en passende behandling er avgjørende for pasientbehandlingen. Polymerase kjedereaksjon (PCR) og kvantitativ sanntid PCR (qPCR) analyser er blitt utviklet for påvisning av C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver 3-5 </ Sup>. Både PCR og qPCR er kostbare og ofte ikke lett tilgjengelig i ressursbegrensede områder for rutinearbeid.
Sløyfe-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) opprinnelig beskrevet av Notomi 6, og tilbyr en alternativ DNA forsterkning metoden. LAMP bruker Bst DNA polymerase for tråd forskyvning DNA-syntese sammen med spesialdesignede primersett som gjenkjenner minst seks selvstendige regioner av målet genet. Den største fordelen av LAMP er at forsterkningen skjer under isotermiske forhold. Derfor er bare et vannbad, varmeblokk eller en inkubator nødvendig. Denne metoden har blitt anvendt for å detektere flere rickettsial patogener 7-9. Visualisering av amplifiserte DNA-produkter ved gelelektroforese er den mest nøyaktige metode som kan skille sanne positive fra falske positive på grunn av ikke-spesifikk amplifikasjon. Men de prosedyrer involvert i gel elektroforese er ikke praktisk for ressursbegrenset arEAS. Flere alternative fremgangsmåter ble utviklet for å detektere reaksjonsproduktene. Disse alternative, for eksempel turbiditet avledet fra magnesium pyrofosfat formasjonen 10 eller ved hjelp av en fluorescerende interkalerende fargestoff for å bli visualisert under UV-lys 11,12 er mer gunstig enn å kjøre en gel. LAMP- reagensene var stabile i en måned når det lagres ved 25 ° C og 37 ° C, som er omgivelsestemperaturer i tropiske og subtropiske land hvor Q-feber er endemisk 13.
En lampe assay ble utviklet i vårt laboratorium for å påvise nærvær av C. burnetii i plasmaprøver 14. Her beskriver vi en enkel protokoll for fremstilling av lampen reaksjonsblandingen fra de lyofiliserte reagenser. De lyofiliserte reagenser er stabile i en måned når det lagres ved romtemperatur. Når det kombineres med en enkel visualisering metode, er dette en ideell metode å bruke for å påvise C. burnetii i en ressursbegrenset setting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere har vi utviklet en sensitiv og spesifikk LAMP analyse rettet mot innsetting element IS1111a 14. Den IS1111 element ble valgt fordi det er sterkt konservert blant de ulike stammer av C. burnetii og sitt høye antall kopier (7-110) i bakterier (Klee 2006). Våre resultater viste at lampen kan detektere omtrent 25 kopier av IS1111 element, som kan relateres til så lite som en kromosomal kopi av Coxiella DNA. I denne studien ble Bst DNA polymerase, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av Naval Medical Research Center, forskningsarbeid enhet 6000.RAD1.J.A0310. Synspunktene i denne artikkelen er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis den offisielle politikk eller plasseringen av Department of the Navy, Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen. Wei-Mei Ching er en ansatt av den amerikanske regjeringen. Dette arbeidet ble utarbeidet som en del av hennes offisielle plikter. Tittel 17 USC §105 fastsetter at "Copyright beskyttelse under denne tittelen er ikke tilgjengelig for noe arbeid av myndighetene i USA. Tittel 17 USC §101 definerer en amerikansk regjering arbeid som arbeid utarbeidet av militærtjeneste medlem eller ansatt av den amerikanske regjeringen som en del av vedkommendes tjenesteplikter.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
