Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, агент , вызывающий лихорадку Q, является облигатным внутриклеточным бактерии. ПЦР – диагностические анализы , основанные были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах. ПЦР требует специального оборудования и обширный обучение пользователей, и, следовательно, он не подходит для рутинной работы, особенно в ограниченных ресурсов области. Мы разработали цикл опосредованной изотермические амплификации (LAMP) анализа для обнаружения присутствия C. burnetii в образцах пациентов. Этот способ осуществляют при одной температуре около 60 ° С на водяной бане или нагревательном блоке. Чувствительность этой лампы анализа очень похож на ПЦР с пределом обнаружения около 25 копий на реакцию. Этот отчет описывает получение реакции с использованием лиофилизованных реагентов и визуализации результатов с использованием hydroxynaphthol синего (HNB) или УФ-лампы с люминесцентным интеркалирующего красителя в реакции. Лампа реагенты lyophiliзет и хранили при комнатной температуре (КТ) в течение одного месяца без потери чувствительности обнаружения. Эта лампа анализ особенно эффективен потому, что препарат реакционной смеси не включает в себя сложные шаги. Этот метод идеально подходит для использования в условиях ограниченных ресурсов, где Q лихорадка является эндемическим заболеванием.
Introduction
Небольшой грамотрицательная бактерия Coxiella burnetii является возбудителем лихорадки Ку, который является во всем мире зоонозов. В связи с распространением по всему миру лихорадки Ку и высокой инфекционности C. burnetii, американские военные и гражданский персонал , развернутые за рубежом находятся под угрозой заражения в эндемичных районах.
Q лихорадка проявляется в двух формах: острых и хронических инфекций. Острый Q-лихорадка представляет себя с симптомами гриппа, гепатита или пневмонии, и, как правило, самоограничения заболевание с низкой смертностью. Хронический Q-лихорадка, в то время как менее распространены, часто приводит к эндокардит, который имеет гораздо более высокий уровень смертности при отсутствии лечения 1,2. Таким образом, ранняя диагностика, чтобы направлять соответствующее лечение имеет решающее значение для ухода за пациентами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) анализы были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах 3-5 </ SUP>. Оба ПЦР и КПЦР являются дорогостоящими и часто не легко доступны в условиях ограниченных ресурсов областей для рутинной работы.
Первоначально описанный Notomi 6, петля-опосредованной изотермические амплификации (LAMP) предлагает альтернативный метод амплификации ДНК. ЛАМПА использует Bst ДНК – полимеразы для синтеза ДНК замещения цепи вместе со специально разработанными наборов праймеров , которые распознают по меньшей мере , шесть независимых областей гена – мишени. Наиболее важным преимуществом является то, что ЛАМПА усиление происходит в изотермических условиях. Таким образом, только на водяной бане, нагревательный блок или инкубатор требуется. Этот метод был использован для обнаружения нескольких риккетсиозные патогены 7-9. Визуализация продуктов амплификации ДНК с помощью гель-электрофореза является наиболее точным методом, который может отличить истинные срабатываний от ложных срабатываний за счет неспецифической амплификации. Однако процедуры, связанные с гель-электрофореза не практичны для ограниченных ресурсов арEAS. Было разработано несколько альтернативных методов для обнаружения продуктов реакции. Эти альтернативные, такие как помутнение полученный из формации пирофосфат магния 10 или с использованием флуоресцентного красителя интеркалирования быть визуализированы под действием УФ – света 11,12 являются более благоприятными , чем при запуске геля. Лампа реагенты были стабильны в течение одного месяца при хранении при температуре 25 ° C и 37 ° C, которые являются температура окружающей среды в тропических и субтропических странах , где Q лихорадка является эндемическим 13.
Пробирного лампа была разработана в нашей лаборатории , чтобы обнаружить присутствие C. burnetii в образцах 14 плазмы. Здесь мы опишем простой протокол для приготовления реакционной смеси в количестве от ЛАМПА лиофилизированных реагентов. Лиофилизированные реагенты стабильны в течение одного месяца при хранении при комнатной температуре. В сочетании с легким методом визуализации, это идеальный способ , чтобы использовать для обнаружения C. burnetii в установлении ограниченных ресурсов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ранее мы разработали чувствительный и специфический анализ ЛАМПЫ таргетирования вставки элемента IS1111a 14. Элемент IS1111 был выбран потому , что он высоко консервативна среди различных штаммов C. burnetii и его высокое число копий ( от 7 до 110) в бактериях (Кли 2006). Наши результ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Военно-морской центр медицинских исследований, научно-исследовательское подразделение 6000.RAD1.J.A0310 работы. Мнения, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают официальную политику или позицию Департамента военно-морского флота, Министерства обороны или правительства США. Вэй-Мэй Чинг является сотрудником правительства США. Эта работа была подготовлена в рамках своих служебных обязанностей. Название 17 USC §105 предусматривает, что «Защита авторских прав в соответствии с этим названием не доступен для любой работы правительства Соединенных Штатов. Название 17 USC §101 определяет работу правительства США в качестве работы, подготовленный членом военной службы или сотрудником правительства США в рамках служебных обязанностей этого лица.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
