A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
Vírus da Influenza A (IAV) hemaglutininas reconhecem ácidos siálicos na superfície celular como receptores funcionais para ganhar a entrada nas células. aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV pode cruzar a barreira das espécies para aves, suínos, cavalos e seres humanos. vírus aviários reconhecer ácido siálico ligado a um penúltimo galactose através de uma ligação α2-3 (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos reconhecem preferencialmente ácido siálico com uma ligação α2-6 (receptores do tipo humano). Para monitorar se os vírus aviários estão a adaptar-se aos receptores do tipo humano, podem ser usados vários métodos. microarrays de glicano com diversas bibliotecas de sialosides sintéticos são cada vez mais utilizadas para avaliar a especificidade do receptor. No entanto, esta técnica não é usada para medir a avidez. Medição de avidez é tipicamente alcançada por avaliação da ligação de hemaglutinina ou de vírus diluído em série a glicanos adsorvidos ao polipropileno placas de 96 poços convencionais. Neste ensaio, os glicanos com α2-3 ou α2-6 ácidos siálicos são acoplados a biotina e adsorvido a placas de estreptavidina, ou são acoplados a poliacrilamida (PAA), que adsorver directamente para o plástico. Temos miniaturizado significativamente este ensaio, imprimindo directamente ligada sialosides-PAA e os seus homólogos não ligada-PAA em lâminas de vidro de micro-poços. Este set-up, com 48 matrizes em um único slide, permite ensaios simultâneos de 6 glicano proteínas de ligação em 8 diluições, interrogando 6 glicanos diferentes, incluindo dois controles não-sialilados. Isto é equivalente a 18x placas de 96 cavidades na placa de ensaio tradicionais. O formato de matriz de glicanos diminui o consumo de compostos e produtos biológicos e, portanto, aumenta muito a eficiência.
Introduction
aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV é capaz de atravessar a barreira das espécies para aves e mamíferos, incluindo os humanos. IAVS aviárias reconheçam α2-3 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos se ligam α2-6 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo humano). Para ser capaz de se replicar eficientemente e transmitir entre seres humanos uma IAV aviária necessita de se ligar a receptores do tipo 1 humano.
IAVS são divididas com base na serologia que caracteriza a sua antigenicidade de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) glicoproteínas do envelope. HA se liga a ácidos siálicos, enquanto que NA é a enzima destruidora de receptor na outra extremidade do ciclo de vida viral e cliva o ácido siálico 2. Todos os vírus que infectam humanos, incluindo H1N1, H2N2 e H3N2, têm uma origem aviária 3. Durante as duas últimas décadas vários aviários para os crossovers humanos ocorreu, com o H5N1, H7N7 e H7N9, sendo o mais conhecido; However, outros subtipos de ter infectado seres humanos mais esporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Felizmente, parece que nenhum destes vírus têm sido inteiramente capaz de se adaptar aos receptores do ácido siálico ligado a α2-6-tipo humano 5-8. Adaptação do vírus zoonóticos aviária ou de outros para acomodar a replicação e transmissão em hospedeiros humanos poderia ter um efeito devastador sobre a saúde humana. Portanto, o conhecimento prévio de como esses vírus estão evoluindo para se ligar receptores do tipo humano ajudará a vigilância mundial do vírus da gripe emergentes.
Determinação da preferência receptor foi elucidada primeiro usando eritrócitos de diferentes espécies e continua a ser um ensaio favorecida entre os pesquisadores da gripe 9-12. A demonstração de que os vírus aviários reconhecer ácido siálico α2-3 e vírus humanos α2-6 ligados ácido siálico foi originalmente baseado em um ensaio utilizando hemaglutinação de eritrócitos enzimaticamente modificados para conter cada uma das linkages 13,14. Embora a leitura é hemaglutinação, um ensaio padrão para virologistas, as estruturas de glicano subjacentes não são definidos, a única ligação terminal. Além disso, a disponibilidade limitada das sialiltransferases, utilizados para re-sialilar as células, têm limitado a utilização deste ensaio 15-18. Subsequentemente, outros métodos de determinação das preferências de ligação ao receptor foram introduzidos usando estruturas de glicanos sialilados, ligado a poli-acrilamida (PAA) ou estruturas poli-glutamato (PGA) nos ensaios baseados em placa 19,20. Diversas variações são possíveis tanto no revestimento os glicanos vírus ou a placas de microtitulação, cada um dos quais resulta em um ensaio de ELISA de tipo robusto, fiável e muito sensível 21-23. Alternativamente, glicanos ligados em biotina pode substituir PAA / PGA e podem ser conjugados com placas revestidas com estreptavidina 2,24. Embora alguns soros específicos podem ser necessários, ELISAs estão glicanos padrão e vários ligados ao PAA são prontamente commercially e não comercialmente disponível (Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org)).
Tecnologias de microarray glicano surgiram como uma ferramenta valiosa para determinar a especificidade de receptor, como vários glicanos diferentes são vistos, e ligação a uma grande variedade de estruturas diferentes pode ser avaliada dentro de um único ensaio 25-29. A ligação dos IAV para estas estruturas fornece uma melhor compreensão das estruturas de glicano que IAV reconhece preferencialmente 30-33. microarrays de glicano requerem pequenas quantidades de volume de amostra para efectuar um ensaio de ligação e utiliza apenas quantidades diminutas de glicano por ponto (2 nl). No entanto, estas matrizes são normalmente utilizados apenas para avaliar a especificidade dos receptores de glicanos. Análise de vários vírus, ou proteínas de hemaglutinina, em vários intervalos de concentração pode ser proibitivo devido ao número de lâminas necessárias. Além disso, até à data, nenhum ensaio de avidez relativa foi desenvolvido usando ar glicanotécnicas de raios.
Para combinar a exigência de baixo amostra proporcionada por técnicas de microarray de glicano e a sensibilidade dos glicanos ligados em PAA em ensaios baseados em ELISA, procurou-se desenvolver uma matriz de glicanos multi-bem que iria permitir a análise de alto rendimento com resolução semelhante ou melhor, em comparação para o ensaio tradicional baseado em ELISA. Simultaneamente, queríamos minimizar a quantidade de produtos biológicos e químicos repórter consumidos. O resultado final é um ensaio de avidez miniaturizado, desenvolvido especificamente para o controlo e especificidade IAV é igualmente aplicável à avaliação de outras proteínas de ligação de glicano. Usando uma lâmina de vidro separada em 48 micro-poços por uma máscara de Teflon, 6 glicanos diferentes são vistos em 6 réplicas por poço. A plataforma de microarray ofereça as mesmas tendências na ligação ao receptor visto no formato macro ELISA com várias vantagens. Estas incluem: (I) a impressão de composto em 6 repetições, utilizando amostra mínima, contra o revestimento de várias linhas iplaca na, usando 100 ul por poço; (II) vários compostos diferentes analisados simultaneamente num único poço, incluindo os controlos; (III) a uma redução maciça no volume de incubação e; (Iv) uma gama dinâmica maior utilizando uma leitura fluorescente. Uma única lâmina pode ser calculada como sendo equivalente a 18x placas de 96 poços.
Com o protocolo seguinte, qualquer laboratório capaz de fabricar e análise manchada microarrays deve ser capaz de fabricar este formato de ELISA miniaturizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avaliando especificidade de receptor IAV é um passo importante na análise do potencial pandemia de vírus aviários. reconhecimento de ácido siálico por o vírus está ligada a várias propriedades biológicas, tais como ligação e libertação a partir da célula. O conhecimento de que mutações de aminoácidos são necessários para vírus aviários para alcançar α2-6 vinculativo e cruzar a barreira das espécies permite preparação para uma pandemia. Vários ensaios são utilizados para determinar a especifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Scripps Microarray Core, e um contrato a partir dos Centros de Controle de Doenças (JCP). RPdV é um beneficiário de uma doação Rubicon e VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). O Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org/) financiado pela concessão NIGMS GM62116 (JCP) forneceu vários glicanos utilizados neste estudo. Esta é a publicação 29113 do The Scripps Research Institute.
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
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