A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l'évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
Le virus grippal A (IAV) hémagglutinines reconnaissent les acides sialique sur la surface de la cellule en tant que récepteurs fonctionnels pour pénétrer dans les cellules. Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV peut traverser la barrière des espèces pour la volaille, les porcs, les chevaux et les humains. Les virus aviaires reconnaissent l'acide sialique attaché à un avant-dernier galactose par une liaison α2-3 (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains reconnaissent de préférence l'acide sialique avec une liaison α2-6 (récepteurs de type humain). Pour contrôler si les virus aviaires s'adaptent aux récepteurs de type humain, plusieurs méthodes peuvent être utilisées. microarrays Glycan avec diverses bibliothèques de sialosides synthétiques sont de plus en plus utilisés pour évaluer la spécificité du récepteur. Cependant, cette technique n'a pas été utilisée pour mesurer avidités. Mesure de l'avidité est généralement obtenue en évaluant la liaison de l'hémagglutinine ou un virus dilué en série à glycanes adsorbés polypropylène plaques à 96 puits classiques. Dans cet essai, avec α glycanes2-3 ou α2-6 acides sialiques sont couplés à la biotine et adsorbés sur des plaques de streptavidine ou sont couplées à polyacrylamide (PAA), qui adsorbe directement à la matière plastique. Nous avons considérablement miniaturisé cet essai en imprimant directement sialosides PAA liés et leurs homologues non PAA lié sur des lames de verre micro-puits. Ce set-up, avec 48 tableaux sur une seule diapositive, permet des dosages simultanés de 6 glycane protéines de liaison à 8 dilutions, interrogeant 6 glycanes différents, y compris deux témoins non sialylés. Ceci est équivalent à 18x plaques à 96 puits dans le dosage de plaque classique. Le format de tableau glycane diminue la consommation de composés et des produits biologiques et améliore l'efficacité ainsi grandement.
Introduction
Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV est capable de traverser la barrière des espèces pour la volaille et les mammifères, y compris les humains. IAV aviaire reconnaissent α2-3 acides sialiques liés (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains se lient α2-6 acides sialiques liés (récepteurs de type humain). Pour être en mesure de se répliquer efficacement et transmettre entre les humains un IAV aviaire a besoin de se lier à de type humain récepteurs 1.
IAVs sont divisés sur la base de tests sérologiques qui caractérise l'antigénicité de l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), les glycoprotéines d'enveloppe. HA se lie aux acides sialiques, tandis que NA est l'enzyme détruisant le récepteur à l'autre extrémité du cycle de vie viral et clive l' acide sialique 2. Tous les virus infectant l' homme, y compris la grippe H1N1, H2N2 et H3N2, ont une origine aviaire 3. Au cours des deux décennies plusieurs aviaire aux croisements humains dernière ont eu lieu, avec le virus H5N1, H7N7 et H7N9 étant le plus connu; however, d' autres sous – types ont infecté des humains de façon plus sporadique (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Heureusement, il semble qu'aucun de ces virus ont été en mesure d'adapter pleinement à l' acide sialique de type humain récepteurs α2-6 liés 5-8. Adaptation des virus zoonotiques aviaire ou d'autres pour accueillir la réplication et la transmission dans des hôtes humains pourraient avoir un effet dévastateur sur la santé humaine. Par conséquent, la connaissance préalable de la façon dont ces virus évoluent pour lier les récepteurs de type humain contribuera à la surveillance mondiale des virus émergents de la grippe.
Détermination de la préférence des récepteurs a été élucidée en utilisant érythrocytes d'espèces différentes et reste un essai privilégié entre les chercheurs de la grippe 9-12. La démonstration que les virus aviaires reconnaissent l'acide sialique α2-3 et virus humains α2-6 liés acide sialique a été basée sur un essai utilisant hémagglutination des érythrocytes enzymatiquement conçus pour contenir chacun des linkages 13,14. Bien que la lecture est hémagglutination, un essai standard pour virologues, les structures glycanniques sous-jacentes ne sont pas définies, seule la liaison terminal. En outre, la disponibilité limitée des sialyltransférases, utilisés pour re-sialyler les cellules, ont limité l'utilisation de ce test 15-18. Par la suite, d' autres méthodes permettant de déterminer les préférences de liaison au récepteur ont été introduites en utilisant des structures de glycanes sialylés liés à la poly-acrylamide (PAA) ou poly-glutamate (PGA) dans des analyses basées sur des structures en forme de plaque 19,20. Plusieurs variantes sont possibles dans le revêtement soit glycanes ou des virus dans des plaques de microtitrage, dont chacune résulte en un dosage de type ELISA robuste, fiable et très sensible 21-23. En variante, les glycanes liés à la biotine peuvent remplacer PAA / PGA et peuvent être conjugués à des plaques revêtues de streptavidine 2,24. Bien que certains sérums spécifiques peuvent être nécessaires, ELISA sont glycanes standard et plusieurs liés à l'AAP sont facilement commercially et non-disponibles dans le commerce (Consortium for Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Technologies de microréseaux Glycan ont émergé comme un outil précieux pour déterminer la spécificité du récepteur, comme plusieurs glycanes différents sont repérés, et se lier à un large éventail de différentes structures peuvent être évaluées dans un seul essai 25-29. La liaison de l' IAV à ces structures fournit une meilleure compréhension des structures glycanniques que IAV reconnaît préférentiellement 30-33. microarrays Glycan nécessitent de petites quantités de volume d'échantillon pour effectuer une analyse de liaison et utilise uniquement des quantités infimes de glycane par point (2 nl). Cependant, ces réseaux sont généralement utilisés seulement pour évaluer la spécificité des glycanes récepteurs. L'analyse de plusieurs virus ou des protéines d'hémagglutinine, à différents intervalles de concentration peut être prohibitif en raison du nombre des lames nécessaires. En outre, à ce jour, aucun test relatif avidement a été développé en utilisant ar glycanedes techniques de rayons.
Pour combiner l'exigence de l'échantillon à faible offerte par les techniques de microréseaux glycanes et la sensibilité des glycanes de l'AAP liés dans des essais basés sur ELISA, nous avons cherché à développer une gamme glycanes multi-puits qui permettrait d'analyse à haut débit avec une résolution similaire ou mieux par rapport le dosage traditionnel à base d'ELISA. En même temps, nous voulions minimiser la quantité de produits biologiques et les produits chimiques rapporteurs consommés. Le résultat final est un test de avidement miniaturisé, spécialement développé pour la surveillance de la spécificité IAV et est également applicable pour évaluer d'autres protéines de liaison glycanes. L'utilisation d'une lame de verre séparé en 48 micro-puits par un masque de Teflon, 6 glycanes différents sont repérés en 6 répétitions par puits. La plate-forme de puces à ADN offrent les mêmes tendances dans la liaison au récepteur vu dans le format macro ELISA avec plusieurs avantages. Celles-ci comprennent (i) l'impression du composé en 6 réplicats, en utilisant un minimum de l'échantillon, par rapport au revêtement de plusieurs lignes iplaque na, en utilisant 100 pi par puits; (II) plusieurs composés différents analysés simultanément dans un seul puits, y compris les contrôles; (III) une diminution massive du volume d'incubation et; (IV) une plage dynamique plus large en utilisant un affichage fluorescent. Une seule diapositive peut être calculée comme équivalente à 18x plaques à 96 puits.
Avec le protocole suivant, tout laboratoire capable de fabriquer et d'analyse des microréseaux repérés devraient être capables de fabriquer ce format ELISA miniaturisé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Évaluer IAV la spécificité du récepteur est une étape importante dans l'analyse de potentiel pandémique de virus aviaires. la reconnaissance de l'acide sialique par le virus est lié à plusieurs propriétés biologiques telles que la liaison et la libération à partir de la cellule. La connaissance des mutations qui en acides aminés sont nécessaires pour les virus aviaires pour atteindre α2-6 de liaison et traversent la barrière des espèces permet la préparation aux pandémies. Plusieurs essais son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par le Fonds Scripps Microarray Core et un contrat par les Centers for Disease Control (PCE). RPDV est un bénéficiaire d'une subvention Rubicon et VENI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO). Le Consortium pour Glycomics fonctionnels (http://www.functionalglycomics.org/) financé par NIGMS subvention GM62116 (JCP) a fourni plusieurs glycanes utilisés dans cette étude. Ceci est la publication 29113 de The Scripps Research Institute.
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
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