インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
機能的な受容体は、細胞への侵入を獲得するようにインフルエンザAウイルス（IAV）赤血球凝集素は、細胞表面上のシアル酸を認識する。野生の水鳥はIAVのための自然宿主であるが、IAVは、家禽、豚、馬やヒトへの種の壁を越えることができます。鳥ウイルスは、ヒトウイルスが優先α2-6結合（人間型受容体）とシアル酸を認識するのに対し、α2-3結合（鳥型受容体）によって最後から二番目のガラクトースに取り付けられたシアル酸を認識する。鳥類ウイルスはヒト型受容体に適合しているかどうかを監視するために、いくつかの方法を用いることができます。合成シアロシドの多様なライブラリーを有するグリカンマイクロアレイはますます受容体特異性を評価するために使用されます。しかし、この技術は、結合活性を測定するために使用されません。結合活性の測定は、典型的には、従来のポリプロピレンの96ウェルプレートに吸着されたグリカンの連続希釈ヘマグルチニンまたはウイルスの結合を評価することによって達成されます。 αとこのアッセイでは、グリカン2-3またはα2-6シアル酸は、ビオチンに結合し、ストレプトアビジンプレートに吸着させ、または直接プラスチックに吸着したポリアクリルアミド（PAA）に結合されています。我々は、有意に直接PAA結合シアロシドマイクロウェルガラススライド上での非PAA結合相手を印刷することによって、このアッセイを小型化しています。このセットアップは、単一のスライド上の48アレイと、二つの非シアル化されたコントロールを含む6種類のグリカンを、尋問、8希釈で6糖鎖結合タンパク質の同時アッセイを可能にします。これは、従来のプレートアッセイで18倍、96ウェルプレートに相当します。グリカンアレイ形式は、化合物および生物学的製剤の消費を減少し、大幅効率が向上します。
Introduction
ワイルド水鳥IAVのための自然宿主であるが、IAVは、ヒトを含む、家禽および哺乳動物に種関門を通過することができます。ヒトウイルスがα2-6結合したシアル酸（ヒト型受容体）に結合するのに対し、鳥IAVsは、α2-3結合したシアル酸（鳥型受容体）を認識します。効率的に複製および鳥類IAVは、ヒト型受容体1に結合する必要がある人間との間で送信できるようにするには。
IAVsは、その赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖タンパク質の抗原性を特徴付ける血清学に基づいて分割されます。 NAはウイルスのライフサイクルと切断するシアル酸2の他端の受容体破壊酵素であるのに対し、HAは、シアル酸に結合します。 H1N1、H2N2およびH3N2を含むすべての人間の感染ウイルスは、鳥類の起源3を持っています。人間のクロスオーバーには、いくつかの鳥十年の最後の2にわたりH5N1、H7N7、およびH7N9で、発生しているが最もよく知られています。ハウ版は、他のサブタイプはより散発的に人間に感染した（H6N1、H7N1、H7N2、H9N2、H10N7、H10N8）4。幸いなことに、これらのウイルスのいずれも完全ヒト型α2-6結合シアル酸受容体5-8に適応できていなかったようです。ヒト宿主内で複製および伝送に対応するために、鳥や他の人獣共通感染ウイルスの適応は、人間の健康に壊滅的な影響を与える可能性があります。したがって、これらのウイルスは、ヒト型受容体に結合するために進化しているかの事前の知識は、新興インフルエンザウイルスの世界的な監視を支援します。
受容体の好みの決意は、最初の異なる種の赤血球を用いて解明し、インフルエンザの研究9-12の間で好まれるアッセイのまましました。鳥ウイルスがα2-3シアル酸およびシアル酸をリンクα2-6ヒトウイルスを認識デモはもともと酵素的に李のそれぞれを含むように操作赤血球の血球凝集反応を用いたアッセイに基づいていましたnkages 13,14。読み出しが赤血球凝集、ウイルス学者のための標準的なアッセイではあるが、根本的なグリカン構造は、端末のみリンケージを定義されていません。さらに、細胞を再シアリル化するために使用するシアリルトランスフェラーゼの限られた可用性は、このアッセイ15-18の使用が制限されています。その後、受容体結合の好みを決定する他の方法は、プレートベースのアッセイ19,20にポリアクリルアミド（PAA）またはポリ-グルタミン酸（PGA）の構造に連結されたシアル化グリカン構造を使用して導入しました。いくつかのバリエーションが、堅牢信頼性が非常に敏感なELISA型アッセイ21-23もたらすその各々は、マイクロタイタープレートにグリカンまたはウイルスのいずれかをコーティング可能です。また、ビオチン結合型グリカンは、PAA / PGAを置き換えることができますし、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート2,24に結合させることができます。いくつかの特定の血清を必要とすることができるが、ELISAはPAAにリンクされている標準およびいくつかのグリカンは、容易にされているcommerciallyおよび非商業的に入手可能な（機能グライコミクスのためのコンソーシアム（http://www.functionalglycomics.org））。
グリカンマイクロアレイ技術は、複数の異なるグリカンがスポットされているように、受容体特異性を決定するための貴重なツールとして浮上しており、異なる構造の広範な配列への結合は、単一のアッセイ25-29内に評価することができます。これらの構造体へのIAVの結合は、IAVが優先30-33を認識グリカン構造のより良い理解を提供します。糖鎖マイクロアレイは、結合アッセイを実行するためのサンプルボリュームの少量を必要とし、唯一のスポット当たりグリカンの微量（2 NL）を使用しています。しかしながら、これらのアレイは、典型的には、グリカン受容体の特異性を評価するためにのみ使用されます。複数の濃度範囲で、複数のウイルス、または赤血球凝集素タンパク質の分析は、必要スライドの数を禁止することができます。また、現在までに、相対的な結合活性アッセイは、グリカンのarを使用して開発されていません線技術。
グリカンマイクロアレイ技術およびELISAベースのアッセイにおけるPAA結合型グリカンの感度によりもたらされる低いサンプル要件を結合するために、我々は、比較して同等以上の分解能で高スループット分析を可能にするマルチウェルグリカンアレイを開発しようとしました従来のELISAベースのアッセイに。同時に、我々は消費生物学的製剤およびレポーター化学物質の量を最小限にしたかったです。最終的な結果は、特にIAV特異性を監視するために開発さ小型化結合活性アッセイであり、他のグリカン結合タンパク質を評価するためにも同様に適用可能です。テフロンマスクで48マイクロウェルに分離ガラススライドを使用して、6つの異なるグリカンは、ウェル当たり6連でスポットします。マイクロアレイプラットフォームは、いくつかの利点を持つマクロELISA形式で見られる受容体結合に同じ傾向が得られます。これらは、いくつかの行Iのコーティングに対して、最小限のサンプルを使用して、6反復中の化合物（I）の印刷を含みますプレート、ウェルあたり100μlのを使用してナ。コントロールを含む単一のウェルに同時に分析（II）複数の異なる化合物; （III）インキュベーション体積との大幅な減少。 （IV）、蛍光読み取りを使用して、より大きなダイナミックレンジ。単一のスライドを18倍、96ウェルプレートに相当するように計算することができます。
以下のプロトコルでは、製造および分析することが可能な任意の研究室は、マイクロアレイは、この小型化されたELISA形式を製造することができる必要がありますスポッティング。
Protocol
Representative Results
Discussion
IAV受容体の特異性を評価することは、鳥ウイルスのパンデミックの可能性を分析する上で重要なステップです。ウイルスによるシアル酸の認識は、そのような細胞からへの結合および放出などのいくつかの生物学的性質に連結されています。鳥ウイルスが結合α2-6達成し、種の壁は、パンデミック対策を可能に交差するの知識は、アミノ酸の変異が必要です。いくつかのアッセイは、受容体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、スクリップスマイクロアレイ基盤施設、及び疾病対策センター（JCP）からの契約によって部分的にサポートされていました。 RPdVは、科学研究費オランダ機構（NWO）からルビコンとVENI助成金の受取人です。 NIGMS助成金GM62116（JCP）によって資金を供給機能グライコミクスのためのコンソーシアム（http://www.functionalglycomics.org/）は、この研究で使用されるいくつかのグリカンを提供します。これは、スクリップス研究所から出版29113です。
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, D49-D53 (2008).
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6′-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D’Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
