Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
Virus de Influenza A (IAV) hemaglutininas reconocen ácidos siálico en la superficie celular como receptores funcionales para poder entrar en las células. Las aves acuáticas salvajes son el reservorio natural de IAV, pero IAV puede cruzar la barrera de las especies de aves de corral, cerdos, caballos y seres humanos. Los virus aviares reconocen ácido siálico unido a una penúltima galactosa mediante un enlace α2-3 (receptores de tipo aviar) mientras que los virus humanos reconocen preferentemente ácido siálico con una articulación (α2-6 receptores de tipo humano). Para controlar si los virus aviares se están adaptando a los receptores de tipo humano, varios métodos se pueden utilizar. microarrays de glicanos con diversas bibliotecas de sialosides sintéticos se utilizan cada vez más para evaluar la especificidad del receptor. Sin embargo, esta técnica no se utiliza para medir avideces. Medición de la avidez se consigue típicamente mediante la evaluación de la unión de la hemaglutinina o virus diluido en serie a glicanos adsorbidos en placas de 96 pocillos de polipropileno convencionales. En este ensayo, los glicanos con α2-3 o α2-6 ácidos siálicos están acoplados a biotina y adsorben a placas de estreptavidina, o se acoplan a poliacrilamida (PAA) que adsorben directamente al plástico. Hemos miniaturizado significativamente este ensayo imprimiendo directamente sialosides PAA-ligado y sus contrapartes no-PAA ligado en portaobjetos de vidrio micro pocillos. Esta puesta a punto, con 48 matrices en una sola diapositiva, permite ensayos simultáneos de 6 glicano proteínas de unión a los 8 diluciones, interrogando 6 glicanos diferentes, incluyendo dos controles no sialilados. Esto es equivalente a 18x placas de 96 pocillos en el ensayo de placa tradicional. El formato de matriz de glicanos disminuye el consumo de compuestos y productos biológicos y de este modo se mejora notablemente la eficiencia.
Introduction
Las aves acuáticas salvajes son el reservorio natural de IAV, pero IAV es capaz de cruzar la barrera de las especies de aves y mamíferos, incluidos los humanos. Virus de este tipo de aves reconocen α2-3 ácidos siálico unido (receptores de tipo aviar), mientras que los virus humanos se unen α2-6 ácidos siálico unido (receptores de tipo humano). Para ser capaz de replicarse y transmitir entre los seres humanos una IAV aviar necesita para unirse a los receptores de tipo humano 1 de manera eficiente.
Virus de este tipo se dividen basado en serología que caracteriza a la antigenicidad de su hemaglutinina (HA) y glicoproteínas de la envoltura de la neuraminidasa (NA). HA se une a los ácidos siálicos, mientras que NA es la enzima destructora del receptor en el otro extremo del ciclo de vida viral, y se unirá de ácido siálico 2. Todos los virus que infectan a humanos, incluyendo H1N1, H2N2 y H3N2, tienen un origen aviar 3. Durante las dos últimas décadas de varias aves a humanos cruces se han producido, con el H5N1, H7N7, H7N9 y siendo el más conocido; Howeembargo, otros subtipos de haber infectado a los humanos de forma más esporádica (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Afortunadamente, parece que ninguno de estos virus han sido capaces de adaptarse plenamente a los receptores de ácido siálico ligado α2-6 de tipo humano 5-8. La adaptación de los virus zoonóticos aviar u otros para dar cabida a la replicación y la transmisión en huéspedes humanos podría tener un efecto devastador sobre la salud humana. Por lo tanto, el conocimiento previo de cómo estos virus están evolucionando para unirse a receptores de tipo humano ayudará a la vigilancia de todo el mundo de los virus de influenza emergentes.
Determinación de preferencia receptor fue aclarada primero usando eritrocitos de diferentes especies y sigue siendo un ensayo favorecida entre los investigadores de la gripe 9-12. La demostración de que los virus aviares reconocen ácido siálico α2-3 y α2-6 virus humanos vinculados ácido siálico se basó originalmente en un ensayo usando la hemaglutinación de eritrocitos enzimáticamente por ingeniería genética para contener cada uno de los linkages 13,14. Aunque la lectura es de hemaglutinación, un ensayo estándar para los virólogos, las estructuras de glicano subyacentes no están definidos, sólo el enlace terminal. Además, la disponibilidad limitada de las sialiltransferasas, que se utiliza para volver a sialylate las células, han limitado el uso de este ensayo 15-18. Posteriormente, se introdujeron otros métodos de determinación de las preferencias de unión al receptor usando las estructuras de glicano sialiladas vinculados a las estructuras de poli-glutamato (PGA) de poli-acrilamida (PAA) o en ensayos basados en la placa de 19,20. Varias variaciones son posibles en el revestimiento de cualquiera de los glicanos o virus a placas de microtitulación, cada uno de lo que resulta en un ensayo de tipo ELISA robusto, fiable y muy sensibles 21-23. Alternativamente, los glicanos de biotina ligada puede sustituir a PAA / PGA y se pueden conjugar a las placas recubiertas con estreptavidina 2,24. Aunque se puede requerir algunos sueros específica, las pruebas ELISA son glicanos estándar y varios enlaces a PAA son fácilmente commerciallY como no disponibles comercialmente (Consorcio para Funcional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Las tecnologías de microarrays de glicanos se han convertido en una herramienta muy valiosa para determinar la especificidad del receptor, como múltiples glicanos diferentes se han manchado, y la unión a una amplia gama de diferentes estructuras pueden ser evaluados dentro de un único ensayo de 25-29. La unión de IAV a estas estructuras proporciona una mejor comprensión de las estructuras de glicano que IAV reconoce preferentemente 30-33. microarrays de glicanos requieren pequeñas cantidades de volumen de muestra para realizar un ensayo de unión y sólo utiliza cantidades muy pequeñas de glicano por punto (2 nl). Sin embargo, estas matrices se utilizan normalmente sólo para evaluar la especificidad de los receptores de glicanos. Análisis de múltiples virus, o proteínas de hemaglutinina, en múltiples intervalos de concentración puede ser prohibitivo debido al número de diapositivas requeridos. Por otra parte, hasta la fecha, ningún ensayo de avidez relativa ha sido desarrollado utilizando ar glicanotécnicas de rayos.
Para combinar el requisito bajo la muestra proporcionada por las técnicas de microarrays de glicanos y la sensibilidad de los glicanos PAA-ligado en ensayos basados en ELISA, hemos tratado de desarrollar una matriz de glicanos de múltiples pocillos que permitiría análisis de alto rendimiento con una resolución similar o mejor en comparación para el ensayo basado en ELISA tradicional. Al mismo tiempo, hemos querido minimizar la cantidad de productos biológicos y químicos consumidos reportero. El resultado final es un ensayo de avidez miniaturizado, desarrollado específicamente para el seguimiento de IAV especificidad y es igualmente aplicable a evaluar otras proteínas de unión de glicano. El uso de un portaobjetos de vidrio separados en 48 micro pozos por una máscara de teflón, 6 glicanos diferentes se han manchado en 6 repeticiones por pocillo. La plataforma de microarrays ofrecen las mismas tendencias en la unión al receptor vistos en el formato ELISA macro con varias ventajas. Estos incluyen (I) de impresión de compuesto en 6 repeticiones, utilizando mínima de la muestra, en comparación con el recubrimiento de varias filas ina placa, usando 100 l por pocillo; (II) múltiples compuestos diferentes analizaron simultáneamente en un único pozo, incluyendo los controles; (III) una disminución masiva en volumen de incubación y; (IV) un rango dinámico más grande, utilizando una lectura fluorescente. Una sola diapositiva se puede calcular que es equivalente a 18x placas de 96 pocillos.
Con el siguiente protocolo, cualquier laboratorio capaz de fabricar y analizar manchado microarrays deben ser capaces de fabricar este formato ELISA miniaturizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La evaluación de la especificidad del receptor IAV es un paso importante en el análisis de potencial pandémico del virus aviares. El ácido siálico reconocimiento por el virus está vinculada a varias propiedades biológicas tales como la unión a y la liberación de la célula. El conocimiento de que las mutaciones de aminoácidos son necesarios para los virus aviares para lograr la unión α2-6 y cruzan la barrera de las especies permite preparación para una pandemia. Varios ensayos se utilizan para determinar la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo para el Scripps Microarray Core, y un contrato de los Centros para el Control de Enfermedades (JCP). RPdV es un beneficiario de una subvención VENI Rubicón y de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO). El Consorcio para Funcional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/), financiado por la subvención GM62116 NIGMS (JCP) proporcionó varios glucanos utilizados en este estudio. Esta es la publicación 29113 de The Scripps Research Institute.
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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