Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Influensa A-virus (IAV) hemagglutinins erkänner sialinsyror på cellytan som funktionella receptorer för att komma in i celler. Vilda sjöfåglar är den naturliga reservoar för IAV, men IAV kan korsa artbarriären till fjäderfä, svin, hästar och människor. Fågelvirus erkänner sialinsyra kopplad till en näst sista galaktos genom en α2-3 koppling (avian typ receptorer) De mänskliga virus erkänna företrädesvis sialinsyra med en α2-6 Lyft (human-typ receptorer). Att övervaka om fågelvirus anpassar sig till humana typ-receptorer, kan flera metoder användas. Glykan mikroarrayer med olika bibliotek av syntetiska sialosides alltmer används för att utvärdera receptorspecificitet. Emellertid är denna teknik inte använts för att mäta aviditeter. Mätning av aviditeten uppnås typiskt genom att utvärdera bindningen av serieutspädd hemagglutinin eller virus till glykaner adsorberade till konventionella polypropen 96-brunnars plattor. I denna analys, glykaner med α2-3 eller α2-6 sialinsyror är kopplade till biotin och adsorberas till streptavidin plattor, eller är kopplade till polyakrylamid (PAA) som direkt bindas till plasten. Vi har avsevärt miniatyriserade denna analys genom att direkt skriva ut PAA-kopplade sialosides och deras icke PAA bundna motsvarigheter på mikro och objektglas. Denna installation, med 48 uppsättningar på en enda bild, möjliggör samtidiga analyser av 6 glykan bindande proteiner på 8 utspädningar förhöra 6 olika glykaner, inklusive två icke-sialylerade kontroller. Detta är ekvivalent med 18x 96-brunnsplattor i den traditionella plattanalys. Den glykan array format minskar konsumtionen av föreningar och biologiska och därmed kraftigt förbättrar effektiviteten.
Vilda sjöfåglar är den naturliga reservoar för IAV, men IAV kan korsa artbarriären till fjäderfä och däggdjur, inklusive människan. Avian IAVs erkänner α2-3 länkade sialinsyror (avian-typ receptorer), medan humana virus binder α2-6 länkade sialinsyror (human-typ receptorer). För att effektivt kunna replikera och överföra mellan människor en avian IAV behöver binda till human-typ receptorer 1.
IAVs är indelade baserat på serologi som präglar antigeniciteten av deras hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) höljesglykoproteiner. HA binder till sialinsyror, medan NA är receptorn förstörande enzym vid den andra änden av det virala livscykeln och klyver sialinsyra 2. Alla mänskliga infekterar virus, inklusive H1N1, H2N2 och H3N2, har en fåglar 3. Under de senaste två decennierna flera avian mänskliga delning har skett, med H5N1, H7N7 och H7N9 är den mest kända; however, har andra subtyper infekterade människor mer sporadiskt (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Lyckligtvis verkar det som om ingen av dessa virus har fullt ut kunnat anpassa sig till mänsklig typ α2-6 bunden sialinsyra receptorer 5-8. Anpassning av fågel- eller andra zoonotiska virus för att rymma replikering och överföring i mänskliga värdar kan ha en förödande effekt på människors hälsa. Därför tidigare kunskap om hur dessa virus utvecklas för att binda human-typ receptorer hjälper världsomfattande övervakning av nya influensavirus.
Fastställande av receptor preferens först klar användning av erytrocyter av olika arter och förblir en gynnad analys bland influensaforskare 9-12. Demonstrationen som fågelvirus erkänner α2-3 sialinsyra och mänskliga virus α2-6 kopplade sialinsyra byggde ursprungligen på en analys med hjälp av hemagglutination av erytrocyter enzymatiskt modifierade att innehålla vart och ett av linkages 13,14. Även om utläsningen är hemagglutination, en standardanalys för virologer, är de underliggande glykanstrukturer inte definierad, bara den terminala bindningen. Dessutom, den begränsade tillgången av sialyltransferaser, som används för att åter sialylate cellerna har begränsat användningen av denna analys 15-18. Därefter tillsattes andra metoder för att bestämma receptorbindande preferenser införas med användning av sialylerade glykanstrukturer kopplade till poly-akrylamid (PAA) eller poly-glutamat (PGA) strukturer i plattbaserade analyser 19,20. Flera variationer är möjliga i beläggning antingen glykaner eller virus till mikrotiterplattor, vilka vardera resulterar i en robust, pålitlig och mycket känslig ELISA-typ analys 21-23. Alternativt kan biotin-länkade glykaner ersätta PAA / PGA och kan konjugeras till streptavidinbelagda plattor 2,24. Även om vissa specifika serum kan behövas, ELISA är standard och flera glykaner kopplade till PAA lätt commercially och icke-kommersiellt tillgänglig (konsortiet för funktionella glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glykan microarray teknik har dykt upp som ett ovärderligt verktyg för att bestämma receptorspecificitet, som flera olika glykaner är fläckig, och bindning till ett brett spektrum av olika strukturer kan bedömas inom en enda analys 25-29. Bindningen av IAV till dessa strukturer ger en bättre förståelse av de glykanstrukturer som IAV känner igen preferentiellt 30-33. Glykan mikroarrayer kräver små mängder provvolym för att utföra en bindningsanalys och använder endast små mängder av glykan per plats (2 nl). Emellertid är dessa matriser som typiskt används endast för att utvärdera specificiteten av glykaner receptorer. Analys av flera virus, eller hemagglutinin proteiner, vid flera koncentrationsintervall kan vara oöverkomliga grund av antalet objektglas som krävs. Dessutom hittills ingen relativ aviditet analys har utvecklats med hjälp av glykan array tekniker.
Att kombinera provet kravet låg ges av glykan microarray teknik och känsligheten hos PAA-kopplade glykaner i ELISA-baserade analyser, försökte vi utveckla en fler väl glykan array som skulle göra det möjligt för hög genomströmning analys med liknande eller bättre upplösning jämfört till den traditionella ELISA-baserad analys. Samtidigt ville vi att minimera mängden av biologiska och reporter kemikalier konsumeras. Det slutliga resultatet är en miniatyriserad aviditet analys speciellt utvecklat för övervakning IAV specificitet och är lika tillämplig för att bedöma andra glykan bindande proteiner. Med hjälp av en glasskiva uppdelad i 48 mikrobrunnar med en teflon mask är 6 olika glykaner fläckig i 6 replikat per brunn. Microarray plattform ger samma trender i receptorbindning sett i makro ELISA-format med flera fördelar. Dessa inkluderar (I) tryckning av föreningen i 6 repliker, med hjälp av minimal prov, jämfört med beläggning av flera rader ina plattan med 100 ul per brunn; (II) flera olika föreningar analyseras samtidigt i en enda brunn, inklusive kontroller; (III) en massiv minskning av inkubation volym och; (IV) en större dynamiskt område genom att använda en fluorescerande avläsning. En enda bild kan beräknas motsvara 18x 96-brunnsplattor.
Med följande protokoll, något lab med förmåga att tillverka och analysera spotted microarrays bör kunna tillverka denna miniatyriserade ELISA-format.
Uppskatta IAV receptorspecificitet är ett viktigt steg i att analysera pandemisk potential fågelvirus. Sialinsyra erkännande av viruset är kopplat till flera biologiska egenskaper såsom bindning till och frisättning från cellen. Kunskap om vilka aminosyra mutationer är nödvändiga för fågelvirus att nå α2-6 bindande och korsar artbarriären möjliggör pandemiberedskap. Flera analyser används för att bestämma receptorspecificitet; Men alla har sina nackdelar, inklusive bara mäta affinitet och inte speci…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av den Scripps microarray Core Facility, och ett kontrakt från Centers for Disease Control (JCP). RPdV är mottagare av en Rubicon och VENI bidrag från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NWO). Konsortiet för Funktionella glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) finansieras av NIGMS bidrag GM62116 (JCP) gav flera glykaner som används i denna studie. Detta är publikation 29113 från The Scripps Research Institute.
NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |