जीन प्रतिलेखन के ठीक ट्यूनिंग विनियमन भ्रूण सेल भाग्य निर्णय underlies। इस के साथ साथ, हम chromatin immunoprecipitation स्टेम कोशिकाओं और माउस भ्रूण की हृदय विकास के दोनों हृदय भेदभाव के epigenetic विनियमन जांच करने के लिए इस्तेमाल किया assays का वर्णन है।
विशिष्ट जीन प्रतिलेखन एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है कि भ्रूण के विकास के दौरान सेल भाग्य के फैसले के पीछे भी है। जैविक प्रक्रिया प्रतिलेखन कारक हैं जो enhancers और हृदय विधान जीनों के प्रमोटरों सहित जीनोमिक विनियामक क्षेत्रों बाँध द्वारा मध्यस्थता है। डीएनए histones कि रासायनिक संशोधनों के अधीन हैं चारों ओर लपेटा जाता है। histones का संशोधन आगे, दमित सक्रिय या तैयार जीन प्रतिलेखन के लिए नेतृत्व इस प्रकार जीन प्रतिलेखन के ठीक ट्यूनिंग विनियमन का एक और स्तर पर लाने। भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते कोशिकाओं) embryoid निकायों (यानी, सेल समुच्चय) हृदय के विकास के प्रारंभिक चरणों के भीतर या 2 डी संस्कृति में पुनरावृत्ति। वे क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के लिए सिद्धांत पर्याप्त सामग्री में प्रदान करते हैं, एक तकनीक मोटे तौर पर जीन विनियामक क्षेत्रों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया। इसके अलावा, मानव ES कोशिकाओं कार्डियोजेनेसिस की एक मानव कोशिका मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। विकास के बाद के चरणों में, माउस भ्रूण के ऊतकों के लिए अनुमतिविशिष्ट epigenetic सेल पहचान के निर्धारण के लिए आवश्यक परिदृश्य की जांच। इस के साथ साथ, हम चिप, अनुक्रमिक चिप के प्रोटोकॉल पीसीआर या चिप अनुक्रमण ते कोशिकाओं, embryoid निकायों और हृदय विशिष्ट भ्रूण क्षेत्रों का उपयोग करके किया वर्णन है। इन प्रोटोकॉल हृदय जीन प्रतिलेखन के epigenetic विनियमन की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं।
दिल पहला अंग का गठन किया जाना है और भ्रूण में कार्यात्मक बन गया है। दिल में कई सेल प्रजातियों कि पहले और दूसरे भ्रूण दिल क्षेत्रों 1 से उठता से बनाया गया है। से पोस्ट-निषेचन ब्लास्टोसिस्ट आकार का दिल करने के लिए मंच, भ्रूण कोशिकाओं इस प्रकार कई सेल भाग्य का निर्णय करना है। जीन प्रतिलेखन एक समय और अंतरिक्ष पर निर्भर ढंग से विनियमित और एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है कि भ्रूण के विकास के दौरान सेल भाग्य के फैसले के पीछे भी है। इस तरह की एक प्रक्रिया विशिष्ट प्रतिलेखन कारक हैं जो enhancers और हृदय विधान जीनों के प्रमोटरों सहित जीनोम के भीतर विनियामक क्षेत्रों बाँध द्वारा मध्यस्थता है। डीएनए histones कि इस तरह के एसिटिलीकरण, मेथिलिकरण, ubiquitinylation, और / या फोस्फोराइलेशन के रूप में संशोधनों के अधीन हैं चारों ओर लपेटा जाता है। हिस्टोन संशोधन, दमित सक्रिय या तैयार जीन के आधार प्रतिलेखन जिस पर हिस्टोन के लाइसिन अवशेषों 2 संशोधित किया गया है की ओर जाता है।
jove_content "> chromatin immunoprecipitation परख (चिप) को 3 साल पहले स्थापित किया गया है और आदेश या तो संशोधित histones या 4। प्रतिलेखन कारक histones या प्रतिलेखन कारक के immunoprecipitation के बाद के लक्ष्यों की पहचान करने के लिए वर्तमान में सबसे मोटे तौर पर तकनीक का इस्तेमाल किया है, बाध्य डीएनए हो सकता है या तो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) से परिलक्षित या अनुक्रम। चिप तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण जेल मंदता assays 5 को दूर किया है। हालांकि चिप डीएनए, जेल मंदता परख के लिए एक लाभ के लिए एक प्रतिलेखन कारक के बंधन सीधा मतलब यह नहीं है। दूसरी ओर, चिप पर डीएनए अनुक्रमण के लिए संयुक्त जीन विनियमन पर एक नया जीनोम चौड़ा परिप्रेक्ष्य खोल दिया है।ES कोशिकाओं (ते कोशिकाओं) embryoid शरीर के भीतर पुनरावृत्ति (यानी।, सेल समुच्चय) या 2 डी संस्कृति हृदय विकास 6 के प्रारंभिक चरणों में और चिप के लिए पर्याप्त सामग्री सिद्धांत में प्रदान करते हैं। इसके अलावा, मानव ES कोशिकाओं सीए की एक मानव कोशिका मॉडल का प्रतिनिधित्वहालांकि उनके हृदयजनित संभावित rdiogenesis उनकी epigenetic हस्ताक्षर 7 पर निर्भर करता है। विकास के बाद के चरणों में, माउस भ्रूण के ऊतकों विशिष्ट epigenetic सेल पहचान के निर्धारण के लिए आवश्यक परिदृश्य की जांच के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, जीनोम एक समय और सेल प्रकार विशिष्ट ढंग से 8 में लिखित है। जीन प्रतिलेखन के Epigenetic विनियमन स्थानीय क्षेत्रों के भीतर का अध्ययन किया जाना है। इस के साथ साथ, हम चिप, अनुक्रमिक चिप के प्रोटोकॉल पीसीआर या अनुक्रमण ते कोशिकाओं, embryoid निकायों और हृदय विशिष्ट भ्रूण क्षेत्रों का उपयोग करके किया वर्णन है। इन प्रोटोकॉल हृदय जीन प्रतिलेखन के epigenetic विनियमन की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं।
एपिजेनेटिक्स विकास जीव विज्ञान में अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गया है। कैसे एक आनुवंशिक प्रोग्राम भ्रूण कोशिकाओं में सक्रिय है एक भ्रूण वंश के भीतर एक विशिष्ट पहचान प्राप्त करने के लिए कोश?…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |