Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels
Summary
Een fijnafstemming regulatie van gentranscriptie ten grondslag ligt aan embryonale cel lot beslissing. Hierin beschrijven we chromatine immunoprecipitatie assays gebruikt om epigenetische regulatie van zowel cardiale differentiatie van stamcellen en cardiale ontwikkeling van muizenembryo's te onderzoeken.
Abstract
Specifiek gen transcriptie is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Het biologisch proces wordt gemedieerd door transcriptiefactoren die genomische regulatoire gebieden zoals enhancers en promoters van cardiale genen constitutieve binden. DNA wordt rond histonen die worden blootgesteld aan chemische modificaties. Modificaties van histonen verder leiden tot een onderdrukte, geactiveerd of poised gentranscriptie, dus brengt een ander niveau van fine tuning regulatie van gentranscriptie. Embryonale stamcellen (ES-cellen) herhalen binnen embryo organen (dwz cel aggregaten) of 2D kweek de vroege stappen van ontwikkeling van het hart. Ze bieden in principe genoeg materiaal voor chromatine immunoprecipitatie (chip), een technologie die in grote lijnen gebruikt om gen regulerende gebieden te identificeren. Verder menselijke embryonale cellen vormen een menselijke cel model van cardiogenese. In latere stadia van ontwikkeling, muis embryonale weefsels mogelijk makenonderzoek naar specifieke epigenetische landschappen die nodig zijn voor de bepaling van de cel identiteit. Hierin beschrijven we de protocollen van de chip, sequentiële ChIP gevolgd door PCR of ChIP-sequencing met behulp van ES-cellen, embryo lichamen en cardiale specifieke embryonale regio's. Deze protocollen laten onderzoeken van de epigenetische regulatie van cardiale gen-transcriptie.
Introduction
Het hart is het eerste orgaan te vormen en functioneel in het embryo worden. Het hart is opgebouwd uit vele cellijnen die voortkomen uit de eerste en tweede embryonale hart velden 1. Uit de post-bevruchting blastocyst stadium tot aan de gevormde hart, embryonale cellen moeten dus veel mobiele beslissingen over het lot te maken. Gene transcriptie wordt geregeld in een tijd- en ruimte-afhankelijke manier en is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Een dergelijke werkwijze wordt gemedieerd door specifieke transcriptiefactoren die regelende gebieden in het genoom waaronder enhancers en promoters van cardiale genen constitutieve binden. DNA wordt rond histonen die onderhevig zijn aan modificaties zoals acetylatie, methylatie, ubiquitinylation en / of fosforylering. Histon modificatie leidt tot onderdrukte, geactiveerd of evenwichtig gentranscriptie afhankelijk van welke lysinerest van histon is gemodificeerd 2.
jove_content "> Chromatine immunoprecipitatie assay (chip) is opgericht jaar geleden 3 en is momenteel de meest algemeen gebruikte technologie om targets van een van beide gemodificeerde histonen of transcriptiefactoren 4. Na immunoprecipitatie van histonen of transcriptiefactoren identificeren, kan gebonden DNA hetzij geamplificeerd door polymerasekettingreactie (PCR) en gesequenced. ChIP heeft technisch overwonnen lastiger gelretardatie assays 5. echter ChIP geen directe binding van een transcriptiefactor aan DNA, een voordeel van gelretardatie assay impliceren. anderzijds, ChIP gecombineerd om DNA sequentiebepaling een nieuwe genoom-brede kijk op genregulatie geopend.ES-cellen (ES-cellen) recapituleren binnen embryo lichamen (bijv., Mobiele aggregaten) of in 2D cultuur van de eerste stappen van de ontwikkeling van het hart 6 en bieden in principe genoeg materiaal voor de chip. Bovendien humane ES-cellen zijn een menselijke cel model cardiogenesis hoewel hun potentieel cardiogene afhankelijk van hun epigenetische handtekening 7. In latere stadia van ontwikkeling, muis embryonale weefsels zorgen voor het onderzoeken van specifieke epigenetische landschappen vereist voor het bepalen van celidentiteit. Echter, het genoom getranscribeerd in een tijds- en celtype-specifieke wijze 8. Epigenetische regulatie van gentranscriptie moet worden bestudeerd in gelokaliseerde gebieden. Hierin beschrijven we de protocollen van de chip, sequentiële ChIP gevolgd door PCR of sequentiebepaling met behulp van ES-cellen, embryo lichamen en cardiale specifieke embryonale regio's. Deze protocollen laten onderzoeken van de epigenetische regulatie van cardiale gen-transcriptie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetica is een belangrijk gebied van onderzoek in ontwikkelingsbiologie geworden. Hoe een genetische programma wordt geactiveerd in embryonale cellen om de cellen te laten verwerven van een specifieke identiteit binnen een embryonale geslacht is al lange tijd een belangrijke vraag voor de ontwikkelingsbiologie biologen.
Chip is in grote lijnen gebruikt in de laatste jaren en gecombineerd om DNA-sequencing volgende verbetering van de resolutie van sequencing. Dit is uitgegroeid tot een kr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
- Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
- Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
- Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
- Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
- Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
- Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
- Brind’Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).
