Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d'embryons de poisson zèbre
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
La plupart des études actuelles de biologie cellulaire et moléculaire sont basées sur des moyennes de la population. Cependant, les événements biologiques importants peuvent être masqués par ces analyses basées sur la population traditionnelle puisque les populations mineures peuvent jouer un rôle majeur dans les processus biologiques et les résultats de la maladie. Comprendre l' expression des gènes dans les populations hétérogènes au niveau de la cellule unique peut (et a) conduire à des idées biologiques et cliniques pertinentes 1,2. Une préoccupation pour les études de développement embryonnaire, dans une plus grande population de cellules, les cellules progénitrices sont souvent sous – représentées, ce qui rend difficile de détecter les changements subtils dans l' expression des gènes qui déclenchent finalement les décisions du destin cellulaire 3. De même, un seul type de cellule peuvent avoir des profils d'expression différents en réponse au microenvironnement 4. Par exemple, les cellules endothéliales résidentes dans le même organe ou dans différents organes (par exemple., De l' aorte ou des reins) présentent une hétérogénéité significative malgré le partage MORP communhological caractéristiques fonctionnelles et 5. En outre, les cellules cancéreuses qui peuplent la même tumeur peuvent également avoir des profils variés ou des mutations moléculaires au niveau cellulaire unique 6.
Dans des systèmes modèles, transcriptomique dans des cellules individuelles a réussi à identifier de nouvelles populations de cellules, caractérisé par des états intermédiaires qui se produisent au cours de la différenciation cellulaire, et ont révélé des réponses cellulaires à des stimuli différentielles 7,8,9. Ces idées auraient été masqués dans des études basées sur la population classiques. embryons de poisson zèbre sont une source extrêmement sous-utilisées de la tige, progéniteurs et la différenciation des cellules pour explorer des questions d'hétérogénéité cellulaire unique et la régulation moléculaire des identités cellulaires au cours du développement. Leur très stéréotypée, ex vivo le développement et la facilité de manipulation génétique font un excellent système modèle pour cette approche 10,11. Plus précisément, une limitation majeure à l'interprétation de la cellule unique genles données e d'expression est que l' identification fiable des nouveaux états de cellules intermédiaires au cours du développement exige une synchronisation très prudent de la collecte des tissus 9. Cela est nécessaire pour assurer que l'hétérogénéité entre les cellules capturées représente l'hétérogénéité au sein d'un tissu à un seul point du temps plutôt que de l'hétérogénéité dans l'expression des gènes présenté par la différenciation des cellules dépendant de l'âge. Par rapport à des souris, le développement de l' embryon de poisson zèbre peut être précisément synchronisée à travers un grand nombre d'embryons 12. En outre, avec les grandes tailles d'embrayage, les embryons de poisson zèbre peuvent être utilisés comme une source abondante de cellules souches et progénitrices.
Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules à partir d'embryons de poisson zèbre et de capturer des cellules individuelles en utilisant un circuit de microfluidique intégré (IFC) puce et autoprep système disponible dans le commerce pour qRT-PCR analyse de l'expression génique. Ce protocole peut être rapidement cessible à tous les essais à haut débit de multiplexage, y compris touteséquençage du transcriptome qui permet une analyse plus complète de l' hétérogénéité cellulaire 13. Il offre également plusieurs avantages aux essais traditionnels d'expression génique. Le protocole d'isolement d'une cellule unique donne une viabilité élevée après FACS, ce qui diminue la proportion de cellules compromis qui sont inclus dans les applications en aval. En utilisant un CFI, les cellules capturées peuvent être directement observées pour évaluer les taux de capture et d'évaluer la santé des cellules morphologiquement. En outre, ce protocole est largement applicable à la communauté de recherche zebrafish, exigeant seulement une ligne de poissons transgéniques étiquetés et l'accès aux technologies de capture de cellules microfluidiques.
Comme preuve de principe, des cellules individuelles dérivées de progéniteurs cardiaques ont été isolés et capturés sur une puce IFC, puis l'abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été mesurée par qRT-PCR. l'analyse de l'expression génique au niveau de la cellule unique démontre que progéniteurs cardiaques coexistent avec leur différeprogéniture ntiating. L'idée tirée de profilage à cellule unique de progéniteurs cardiaques peut faire la lumière sur l'hétérogénéité des profils d'expression génique entre les cellules progénitrices cardiaques au cours du développement des vertébrés, qui peuvent avoir été masqués dans les analyses basées sur la population traditionnelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procédé décrit ici utilise l'expression d'une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur spécifique de type cellulaire pour enrichir une population de cellules souches cardiaques à partir d'embryons de poisson zèbre pour une utilisation dans microfluidique système assisté de capture de cellule unique pour évaluer l'expression d'un sous-ensemble de gènes cardiaques en simple cellules. À condition que FACS excitation laser et d'émission de capacités sont compatibles…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
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