Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo's
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
De meeste huidige studies van de cel- en moleculaire biologie gebaseerd op gemiddelden populatie. Echter, belangrijke biologische gebeurtenissen worden gemaskeerd door deze traditionele bevolking op basis van analyses aangezien kleine populatie grote rol in biologische processen en de ziekte uitkomst kunnen spelen. Inzicht in genexpressie in heterogene populatie in de enkele cel niveau kan (en moet) leiden tot relevante biologische en klinische inzichten 1,2. Van belang voor studies embryonale ontwikkeling, in een grotere populatie van cellen, progenitorcellen vaak ondervertegenwoordigd, waardoor het een uitdaging om subtiele veranderingen in genexpressie die uiteindelijk lot van de cel beslissingen 3 initiëren detecteren. Evenzo kan een enkel celtype verschillende expressieprofielen hebben in reactie op de micro 4. Bijvoorbeeld, woonachtig endotheelcellen in hetzelfde orgaan of in verschillende organen (bijv., Aorta of nier) vertonen aanzienlijke heterogeniteit, ondanks het delen van gemeenschappelijke morphological en functionele kenmerken 5. Bovendien kunnen kankercellen bevolken dezelfde tumor ook variërende moleculaire profielen of mutaties op de enkele cel niveau 6.
In modelsystemen heeft transcriptomics in enkele cellen met succes geïdentificeerd nieuwe cel populaties, gekenmerkt tussenliggende staten die optreden tijdens de celdifferentiatie, en onthulde differentiële cellulaire reacties op stimuli 7,8,9. Dergelijke inzichten zou zijn gemaskeerd in conventionele bevolking op basis van studies. Zebravis embryo's zijn een enorm weinig gebruikte bron van stamcellen, voorlopercellen, en differentiërende cellen voor het verkennen van vragen van enkele cel heterogeniteit en moleculaire regulatie van cellulaire identiteiten tijdens de ontwikkeling. Hun zeer stereotiep, ex vivo ontwikkeling en het gemak van genetische manipulatie maken ze een uitstekend modelsysteem voor deze aanpak 10,11. In het bijzonder, een belangrijke beperking van de interpretatie van enkele cel gene uitdrukking gegevens is dat een betrouwbare identificatie van nieuwe intermediaire cel toestanden tijdens de ontwikkeling vereist zeer zorgvuldige timing van weefsel collectie 9. Dit is nodig om ervoor te zorgen dat de heterogeniteit tussen gevangen cellen vertegenwoordigt heterogeniteit binnen een weefsel op een enkel tijdstip in plaats van heterogeniteit in genexpressie door leeftijdsafhankelijke celdifferentiatie. In vergelijking met muizen kunnen zebravisembryo ontwikkeling nauwkeurig gesynchroniseerd over een groot aantal embryo's 12. Bovendien, met grote clutch formaten zebravisembryo's kunnen worden gebruikt als een rijke bron van stamcellen en progenitorcellen.
Dit protocol beschrijft een werkwijze om cellen van zebravis embryo's te isoleren en te vangen enkele cellen met behulp van een commercieel verkrijgbare geïntegreerde schakeling microfluidics (IFC) chip en autoprep voor qRT-PCR analyse van genexpressie. Dit protocol kan snel overdraagbaar aan een high throughput multiplexing assays waaronder geheeltranscriptoom sequencing dat meer uitgebreide analyse van de cellulaire heterogeniteit 13 toelaat. Het biedt ook een aantal voordelen aan traditionele genexpressie testen. Ééncellig isolatieprotocol levert hoge levensvatbaarheid na FACS, waar het aantal besmette cellen die zijn opgenomen in stroomafwaartse toepassingen afneemt. Door het gebruik van een IFC, kan gevangen cellen direct worden genomen om vast te leggen tarieven te evalueren en morfologisch beoordelen gezondheid van de cellen. Bovendien, dit protocol is breed toepasbaar op de zebravis onderzoek gemeenschap, is er slechts een label transgene vis lijn en toegang tot microfluïdische cel afvangtechnologieën.
Als bewijs van het principe werden afzonderlijke cellen afkomstig van cardiale progenitors geïsoleerd en vastgelegd op een IFC chip, en vervolgens de relatieve hoeveelheid van cardiale differentiatie merkers werd gemeten met qRT-PCR. Genexpressie analyse op de single cell niveau toont aan dat cardiale voorlopercellen samengaan met hun differentiating nageslacht. Het inzicht verkregen uit eencellige profilering van cardiale voorlopercellen kan licht werpen op de heterogeniteit in genexpressie patronen onder cardiale stamcellen tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren, die kunnen zijn gemaskeerd in de traditionele bevolking op basis van analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van expressie van een fluorescerend eiwit onder controle van een cel-type specifieke promotor om een populatie van cardiale progenitorcellen van zebravis embryo's voor gebruik in microfluïdische steungebied eencellige beeldverwerkingssysteem verrijken expressie van een subset van cardiale genen in één evalueren cellen. Mits FACS laser excitatie en emissie vermogen verenigbaar met het fluorofoor (s) naar keuze, kan deze methode worden gebruikt voor elke fluorescer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
