Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em> In Vitro</em> /<em> In silico</em> Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
En el presente estudio, se combinaron un modelo de tumor in vitro 3D de pulmón con una en el modelo de silico para optimizar las predicciones de la respuesta al fármaco basado en un fondo mutacional específico. El modelo se genera en un andamio porcino descelularizado que reproduce las características específicas de tejido con respecto a composición de la matriz extracelular y la arquitectura que incluye la membrana basal. Se estandarizó un protocolo que permite la generación de tejido tumoral artificial dentro de los 14 días incluyendo tres días de tratamiento con fármacos. Nuestro artículo proporciona varias descripciones detalladas de 3D técnicas de detección de lectura como la determinación del índice de proliferación Ki67 de tinción, la apoptosis de los sobrenadantes por M30-ELISA y la evaluación de transición epitelial a mesenquimal (EMT), que son herramientas útiles para evaluar la eficacia de compuestos terapéuticos. Hemos podido demostrar comparación con el cultivo 2D una reducción de la proliferación tumoral en nuestro modelo 3D que es related a la situación clínica. A pesar de esta proliferación inferior, el modelo predijo EGFR respuestas de drogas -targeted correctamente de acuerdo con el estado de biomarcadores, como se muestra por comparación de las líneas celulares de carcinoma de pulmón HCC827 (EGFR -mutated, KRAS de tipo salvaje) y A549 (EGFR de tipo salvaje, KRAS – mutado) tratados con gefitinib el inhibidor de la tirosina quinasa (TKI). Para investigar las respuestas de drogas de las células tumorales más avanzados, se indujo EMT por tratamiento a largo plazo con TGF-beta-1 según la evaluación de la vimentina / tinción de inmunofluorescencia pan-citoqueratina. Un flujo-biorreactor fue empleado para ajustar la cultura a las condiciones fisiológicas, lo que mejoró la generación de tejido. Además, se muestra la integración de las respuestas de drogas tras el tratamiento con gefitinib o TGF-beta-1 estimulación – la apoptosis, el índice de proliferación y EMT – en un booleano en el modelo in silico. Además, explicamos cómo las respuestas de drogas de las células tumorales con un fondo de mutación específica y recuentoerstrategies contra la resistencia se pueden predecir. Estamos seguros de que nuestro enfoque en 3D vitro sobre todo con su expansión in silico proporciona un valor adicional para las pruebas de drogas preclínica en condiciones más realistas que en el cultivo de células 2D.
Introduction
La industria farmacéutica se enfrenta a altas tasas de deserción de hasta el 95% en el campo del tratamiento del cáncer en la fase clínica causando enormes costos 1-5. Una razón de este déficit es el hecho de que en la actualidad eficacia de potenciales nuevos compuestos se evaluó en pruebas de detección a gran escala en cultivos de células 2D de líneas celulares de cáncer o en modelos animales. Los modelos animales tienen una complejidad mayor, pero hay diferencias cruciales entre ratones y hombres 6,7. En la última década, los modelos de cáncer en 3D usando diferentes enfoques que se han generado para cerrar la brecha entre la cultura 2D de líneas celulares de cáncer y un complejo de 6,8,9 tumoral in vivo. El impacto de entorno 3D sobre la diferenciación celular y también en la señalización se ha demostrado en varios estudios hace años (por ejemplo., Por Mina Bissell) 10,11. Hoy en día, muchos modelos de cultivo de células en 3D están disponibles, tales como cultivos de esferoides, hidrogeles o chips de microfluidos 12-16. A pesar de que Tsmodelos e mejorar la complejidad en comparación con los sistemas de cultivo 2D convencionales, que en su mayoría carecen de un microambiente del tejido que se sabe que tiene efectos de soporte tumorales y también afecta a la eficacia del fármaco.
Para solucionar este problema, hemos generado un modelo de tumor en 3D basado en un andamio biológico llamado SISmuc (intestino delgado-submucosa + mucosa) que se deriva de un yeyuno porcino descelularizado. De este modo, la arquitectura del tejido y los componentes importantes de la ECM tales como diferentes colágenos, así como la estructura de la membrana basal se conservan 17. Esta característica única es crucial para la generación de modelo de tumor de carcinomas que surgen de epitelio y comprenden alrededor del 80% de los tumores sólidos. Por otra parte, la tasa de proliferación en nuestro modelo de tumor de tejido modificado se reduce en comparación con las tasas artificialmente altos alcanzados en la cultura 2D. Como la proliferación es un parámetro importante en la evaluación de la eficacia del fármaco, las pruebas de drogas está habilitada en nuestro modelo en más similarescondiciones a los tumores in vivo 17.
Con el fin de evaluar el potencial de nuestro modelo para predecir la eficacia del fármaco biomarcador dependiente correctamente, los datos aquí presentes para dos líneas celulares de cáncer de pulmón diferentes que difieren en su estado de EGFR -biomarker. Este estado mutacional ha comenzado a ser determinado de forma rutinaria en pacientes con NSCLC. Tratamientos dirigidos con TKIs como el EGFR gefitinib -inhibidor contra tumores que llevan una activación de demostración mutación de EGFR resultados superiores en comparación con aquellos con quimioterapia basada en platino 18-21.
Hemos establecido varias técnicas de lectura que son relevantes para la evaluación de la eficacia del compuesto. Además, después de TGF-beta-1 estimulación estamos en condiciones de investigar las acciones de compuestos en las células tumorales que se inició el proceso de EMT, que se cree que es un paso importante en la transformación maligna 22,23 y que está conectado a resistan drogasce 24.
El modelo de tumor 3D permiten monitorear las respuestas de células específicas de tratamientos dirigidos a, quimioterapia o combinaciones de fármacos con buenos contrastes. Para mejorar y acelerar el fármaco de selección y para encontrar resistencia, esto se complementa con una simulación en silico. Sobre la base de algunos experimentos, la respuesta del tumor puede ser predicho in silico con respecto al resultado de una amplia gama de fármacos y sus combinaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos establecido un combinarse in vitro / in silico sistema de prueba de tumor para las predicciones de tratamiento de biomarcadores guiada. El modelo in vitro evalúa diferentes aspectos importantes de acciones compuestas tales como cambios en la proliferación de células tumorales y la apoptosis en un fondo mutacional específico que también se pueden simular in silico 17. A continuación, presentamos el protocolo estandarizado para la generación de modelos 3D del tumor y el e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue patrocinada por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF, BD247 subvención) del Hospital de la Universidad de Würzburg y el programa Bayern Fit (concedida a Heike Walles).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
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