A Tissue Combinada 3D Engineered<em> In Vitro</em> /<em> In Silico</em> Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
No presente estudo, nós combinamos um modelo de tumor in vitro 3D pulmão com um modelo em silico para otimizar previsões de resposta à droga com base em um fundo mutacional específico. O modelo é gerado num andaime porcino descelularizado que reproduz as características específicas de tecidos em relação à composição da matriz extracelular e arquitectura, incluindo a membrana basal. Nós padronizado um protocolo que permite a geração de tecido tumoral artificial no prazo de 14 dias incluindo três dias de tratamento com fármaco. Nosso artigo fornece várias descrições detalhadas de 3D leitura de técnicas de rastreio, como a determinação da do índice de proliferação Ki67 coloração, a apoptose a partir de sobrenadantes por M30-ELISA e avaliação de epitelial para mesenquimal (EMT), que são ferramentas úteis para avaliar a eficácia das compostos terapêuticos. Pudéssemos mostrar em relação à cultura 2D uma redução da proliferação em nosso modelo de tumor em 3D que é related com a situação clínica. Apesar desta proliferação inferior, o modelo previu EGFR de respostas ao fármaco -targeted correctamente de acordo com o estado biomarcador como se mostra por comparação das linhas de células de carcinoma de pulmão HCC827 (EGFR -mutated, KRAS do tipo selvagem) e A549 (EGFR de tipo selvagem, KRAS – mutado) tratados com o inibidor da tirosina-gefitinib cinase (TKI). Para investigar as respostas de drogas de células de tumor mais avançadas, EMT induzida por tratamento de longo prazo com TGF-beta-1, tal como avaliado por vimentina / imunofluorescência pan-citoqueratina. Um fluxo-biorreator foi empregado para ajustar a cultura às condições fisiológicas, o que melhorou a geração de tecido. Além disso, vamos mostrar a integração de respostas de drogas após tratamento gefitinib ou TGF-beta-1 de estimulação – a apoptose, índice de proliferação e EMT – em um booleano no modelo silico. Além disso, explicamos como respostas de drogas de células de tumor com um fundo mutacional específico e contagemerstrategies contra a resistência pode ser previsto. Estamos confiantes de que o nosso 3D abordagem in vitro especialmente com sua expansão in silico proporciona um valor adicional para testes de drogas pré-clínicos em condições mais realistas do que na cultura de células 2D.
Introduction
A indústria farmacêutica está de frente para altas taxas de desgaste de até 95% no domínio do tratamento do cancro em fase clínica provocando enormes custos 1-5. Uma razão para este défice é o facto de, actualmente eficácia de potenciais novos compostos é avaliada em rastreios de grande escala em culturas de células em 2D de linhas de células de cancro ou em modelos animais. Os modelos animais têm uma complexidade maior, mas existem diferenças cruciais entre ratos e homens 6,7. Na última década, modelos de cancro em 3D usando diferentes abordagens têm sido gerados para preencher a lacuna entre a cultura 2D de linhas celulares de cancro e um complexo de 6,8,9 tumor vivo. O impacto do ambiente 3D na diferenciação celular e também na sinalização tem sido demonstrado em vários estudos anos atrás (por ex., Por Mina Bissell) 10,11. Hoje em dia, muitos modelos de cultura de células estão disponíveis em 3D, tais como culturas de esferóides, hidrogéis ou chips de microfluidos 12-16. Mesmo que Tse modelos aumentarão a complexidade em relação aos sistemas convencionais de cultura 2D, que principalmente carecem de um microambiente tecido que é conhecido por ter efeitos apoiando-tumorais e também impactos eficácia da droga.
Para abordar esta questão, geramos um modelo de tumor 3D baseado em um andaime biológico chamado SISmuc (do intestino delgado-submucosa + mucosa), que é derivado de um jejuno porcinos descelularizados. Deste modo, a arquitectura do tecido e os componentes importantes da ECM, tais como diferentes colagénios, bem como a estrutura da membrana basal são preservados 17. Esta característica única é crucial para a geração modelo de tumor de carcinomas que surgem a partir do epitélio e compreendem cerca de 80% de tumores sólidos. Além disso, a taxa de proliferação no nosso modelo de tumor da engenharia de tecidos é reduzida em comparação com as elevadas taxas artificialmente alcançados na cultura 2D. Como a proliferação é um parâmetro importante para avaliar a eficácia dos medicamentos, testes de drogas está habilitado no nosso modelo em mais semelhantecondições para in vivo tumores 17.
A fim de avaliar o potencial do nosso modelo para prever a eficácia do fármaco-dependentes biomarcador corretamente, os dados aqui presentes para duas linhas de células de câncer de pulmão diferentes que diferem em seu estado EGFR -biomarker. Este estado mutacional começou a ser determinado rotineiramente em pacientes com NSCLC. Tratamentos direcionados com TKI como o EGFR -inhibitor gefitinib contra tumores que carregam uma mutação ativando mostra EGFR resultados superiores em comparação com aqueles com quimioterapia à base de platina 18-21.
Nós estabelecemos várias técnicas de leitura que são relevantes para avaliar a eficácia do composto. Além disso, após a TGF-beta-1 a estimulação somos capazes de investigar as acções de compostos em células tumorais que iniciou o processo de EMT, que se pensa ser uma etapa importante na transformação maligna 22,23 e que está ligado à droga resistance 24.
O modelo de tumor 3D permitem monitorar as respostas específicas de células para tratamentos dirigidos, quimioterapia, ou combinações de fármacos com boa contrastes. Para melhorar ainda mais e acelerar droga triagem e encontrar resistência, isto é complementado por uma simulação em silico. Com base em algumas experiências, a resposta do tumor pode ser previsto no silício em relação ao resultado de uma ampla gama de medicamentos e suas combinações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós estabelecemos um combinado in vitro / in sistema de teste tumor silico para previsões de tratamento guiado por biomarcadores. O modelo in vitro avalia diferentes aspectos importantes de acções compostos, tais como mudanças de proliferação de células tumorais e a apoptose em um fundo mutacional específico, que também pode ser simulada in silico 17. Aqui, apresentamos o protocolo padronizado para 3D geração de modelo de tumor e teste composto incluindo a quant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi patrocinada pelo Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (IZKF, BD247 concessão) do Hospital Universitário de Wuerzburg eo programa Bayern Fit (concedido a Heike Walles).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
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