Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em> In Vitro</em> /<em> In Silico</em> Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
In der vorliegenden Studie, kombiniert wir ein in vitro – 3D – Lungentumormodell mit einem in silico – Modell Vorhersagen der Arzneimittelreaktion zu optimieren basierend auf einem bestimmten Mutations – Hintergrund. Das Modell ist auf einem dezellularisierter Schweine Gerüst erzeugt, die gewebespezifische Eigenschaften in Bezug auf extrazelluläre Matrix-Zusammensetzung und Architektur einschließlich der Basalmembran wiedergibt. Wir standardisiert ein Protokoll, das innerhalb von 14 Tagen mit drei Tagen der medikamentösen Behandlung künstlichen Tumorgewebe Generation ermöglicht. Unser Artikel stellt einige detaillierte Beschreibungen von 3D – Auslese Screening – Techniken wie die Bestimmung des Proliferationsindex Ki67 – Färbung der Apoptose von Überständen von M30-ELISA und Beurteilung von epithelialen zu mesenchymale Transition (EMT), die hilfreiche Werkzeuge sind für die Bewertung der Wirksamkeit von therapeutischen Verbindungen. Wir konnten zeigen, eine Reduktion der Proliferation in unserem 3D-Tumormodell in 2D-Kultur verglichen, die relat isted der klinischen Situation. Trotz dieser geringeren Proliferation prognostiziert das Modell EGFR -targeted Droge Antworten korrekt entsprechend dem Status von Biomarkern wie durch einen Vergleich der Lungenkarzinomzelllinien HCC827 (EGFR -mutated, KRAS – Wildtyp) und A549 (EGFR Wildtyp – KRAS – mutiert mit der Tyrosin-Kinase – Inhibitor (TKI) Gefitinib behandelt). Um Drogen Antworten von fortgeschrittenen Tumorzellen zu untersuchen, wir EMT durch langfristige Behandlung mit TGF-beta-1 induziert, wie durch Vimentin / pan-Zytokeratin Immunfluoreszenzanfärbung beurteilt. Ein strömungs Bioreaktor wurde verwendet Kultur physiologischen Bedingungen einzustellen, die Gewebebildung verbessert. Darüber hinaus zeigen wir die Integration von Drogen Antworten auf Gefitinib Behandlung oder TGF-beta-1 – Stimulation – die Apoptose, Proliferationsindex und EMT – in ein Boolean in silico – Modell. Darüber hinaus erläutern wir, wie Arzneimittelreaktionen von Tumorzellen mit einem bestimmten Mutations-Hintergrund und Zählungerstrategies gegen Widerstand vorhergesagt werden. Wir sind zuversichtlich , dass unsere 3D – In – vitro – Ansatz vor allem mit seinen in silico Expansion für die präklinische Drogentests in realistischer Bedingungen als in 2D – Zellkultur einen zusätzlichen Wert liefert.
Introduction
Die pharmazeutische Industrie steht vor hohen Ausfallraten von bis zu 95% im Bereich der Krebstherapie in der klinischen Phase verursacht enorme Kosten 1-5. Ein Grund für diesen Mangel ist die Tatsache, dass zur Zeit die Wirksamkeit von potentiellen neuen Verbindungen bewertet wird in großem Maßstab Screenings auf 2D-Zellkulturen von Krebszelllinien, oder in Tiermodellen. Tiermodelle haben eine höhere Komplexität , aber es gibt entscheidende Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen 6,7. In den letzten zehn Jahren Modelle 3D Krebs verschiedene Ansätze wurden erzeugt , um die Lücke zwischen 2D – Kultur von Krebszelllinien und einem Komplex in vivo Tumor 6,8,9 zu überbrücken. Die Auswirkungen der 3D – Umgebung auf die Zelldifferenzierung und auch Signalisierung in mehreren Studien wurde Jahren gezeigt (z. B. durch Mina Bissell) 10,11. Heute sind viele 3D – Zellkulturmodelle zur Verfügung, wie Sphäroid – Kulturen, Hydrogele oder Mikrofluidik – Chips 12-16. Obwohl these-Modelle Komplexität im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kultursystemen zu verbessern, sie eine Gewebemikroumgebung meist fehlen, die bekannt ist, Tumor-tragenden Effekte und hat auch Auswirkungen auf die Arzneimittelwirksamkeit zu haben.
Um dieses Problem zu beheben, haben wir einen ein 3D – Modell Tumor auf der Basis eines biologischen Gerüst SISmuc (small-Darm-Submukosa + Schleimhaut) genannt , die von einem dezellularisierter Schweine Jejunum abgeleitet wird. Dadurch werden die Gewebearchitektur und wichtige Komponenten der ECM wie verschiedene Kollagene sowie der Basalmembran Struktur 17 erhalten. Diese einzigartige Funktion ist für die Tumormodellgeneration von Karzinomen von entscheidender Bedeutung, die von Epithelien und umfassen etwa 80% von soliden Tumoren entstehen. Darüber hinaus wird die Proliferationsrate in unserem Tissue-Engineering-Tumormodell reduziert im Vergleich zu den künstlich hohen Raten in 2D-Kultur erreicht. Wie Proliferation bei der Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten ist ein wichtiger Parameter, Drogentests ist in unserem Modell ermöglicht in ähnlicherBedingungen in vivo Tumoren 17.
Um das Potenzial unseres Modells zu bewerten Biomarker-abhängige Wirksamkeit von Medikamenten , korrekt vorherzusagen, wir hier vorliegenden Daten für zwei verschiedene Lungenkrebszelllinien , die in ihrem EGFR -biomarker Status unterscheiden. Dieser Mutationsstatus hat begonnen routinemßig in NSCLC-Patienten bestimmt werden. Gezielte Behandlungen mit TKI wie der EGFR -Inhibitor Gefitinib gegen Tumoren eine aktivierende EGFR – Mutation zeigen hervorragende Ergebnisse tragen im Vergleich zu denen mit einer platinbasierten Chemotherapie 18-21.
Wir stellten verschiedene Techniken Auslesen, die zur Bewertung der Wirksamkeit Verbindung relevant sind. Weiterhin wird nach TGF-beta-1 – Stimulation sind wir in der Lage Verbindung Aktionen in Tumorzellen zu untersuchen, die die EMT – Prozess gestartet, der angenommen wird , ein wichtiger Schritt in der malignen Transformation 22,23 zu sein , und die mit dem Drogen resistan verbunden istce 24.
Das 3D-Modell Tumor ermöglichen die Überwachung zellspezifische Antworten auf gezielte Behandlungen, Chemotherapie oder Medikamentenkombinationen mit guten Kontrasten. Zur weiteren Verbesserung und Drogen-Screening zu beschleunigen und Widerstand zu begegnen, wird dies durch eine in silico Simulation ergänzt. Basierend auf einigen Versuchen kann der Tumor – Antwort in silico vorhergesagt werden , in Bezug auf das Ergebnis für eine breite Palette von Medikamenten und deren Kombinationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine in vitro kombiniert etabliert / in silico Tumortestsystem für die Biomarker-gestützte Behandlung Vorhersagen. Die in – vitro – Modell bewertet verschiedene wichtige Aspekte der Verbindung Maßnahmen wie beispielsweise Veränderungen der Tumorzellproliferation und Apoptose auf einer spezifischen Mutations Hintergrund, der auch 17 in silico simuliert werden können. Hier präsentieren wir das standardisierte Protokoll für die 3D – Tumormodell Erzeug…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das Zentrum für Interdisziplinäre Klinische Forschung (IZKF, Zuschuss BD247) der Universitätsklinik Würzburg und der Bayern Fit-Programm (erteilt Heike Walles) gefördert.
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
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