En kombinerad 3D vävnadstekniska<em> In Vitro</em> /<em> In silico</em> Lungtumör modell för att förutsäga läkemedelseffektivitet i specifika Mutations bakgrunder
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
I den aktuella studien, vi kombinerat ett in vitro 3D lungtumör modell med en in silico modell för att optimera förutsägelser om läkemedelssvar baserat på en specifik mutations bakgrund. Modellen genereras på en decellulariserad svinbyggnadsställning som återger vävnadsspecifika egenskaper avseende extracellulärt matriskomposition och arkitektur, inklusive basalmembranet. Vi standardiserat ett protokoll som gör konstgjord tumörvävnad generation inom 14 dagar inklusive tre dagars läkemedelsbehandling. Vår artikel ger flera detaljerade beskrivningar av 3D utläsning screeningstekniker som fastställandet av spridningen index Ki67 färgning talet, apoptos från supernatanter av M30-ELISA och bedömning av epitelceller till mesenkymala övergång (EMT), som är användbara verktyg för att utvärdera effektiviteten i terapeutiska föreningar. Vi kunde visa jämfört med 2D kultur en minskning av proliferation i vår 3D tumörmodell som är related till den kliniska situationen. Trots detta lägre spridning, förutspådde modellen EGFR -targeted läkemedelssvar korrekt enligt biomarkör status som visas genom jämförelse av lungkarcinom cellinjerna HCC827 (EGFR -mutated, KRAS vildtyp) och A549 (EGFR vildtyp, KRAS – muterad) behandlades med tyrosin-kinashämmare (TKI) gefitinib. För att undersöka läkemedelssvar på mer avancerade tumörceller, vi inducerad EMT av långtidsbehandling med TGF-beta-1 som bedöms av vimentin / pan-cytokeratin immunofluorescensfärgning. En flödes bioreaktor användes för att justera kultur till fysiologiska förhållanden, vilket förbättrade vävnad generation. Dessutom visar vi integrationen av svaren drog på gefitinib behandling eller TGF-beta-1-stimulering – apoptos, proliferation index och EMT – till ett logiskt in silico modell. Dessutom förklarar vi hur läkemedels svar tumörceller med en specifik mutations bakgrund och räknaerstrategies mot motstånd kan förutsägas. Vi är övertygade om att vår 3D in vitro metod speciellt med in silico expansionen ger ytterligare värde för preklinisk drogtestning i mer realistiska förhållanden än i 2D cellodling.
Introduction
Läkemedelsindustrin står inför höga personalomsättning på upp till 95% när det gäller cancerbehandling i klinisk fas orsakar enorma kostnader 1-5. En orsak till denna brist är det faktum att för närvarande effekten av potentiella nya föreningar bedöms i storskaliga visningar på 2D cellkulturer av cancercellinjer eller i djurmodeller. Djurmodeller har en högre komplexitet, men det finns avgörande skillnader mellan möss och män 6,7. Under det senaste decenniet, har 3D-cancermodeller med olika metoder tagits fram för att överbrygga klyftan mellan 2D kultur av cancercellinjer och en komplex in vivo tumör 6,8,9. Effekterna av 3D-miljö på celldifferentiering och även om signalering har visats i flera studier år sedan (eg., Genom Mina Bissell) 10,11. Idag är många 3D cellodlingsmodeller finns såsom sfäroida kulturer, hydrogeler eller mikroflödes chips 12-16. Även om thesE-modellerna ökar komplexiteten jämfört med konventionella 2D odlingssystem, de oftast saknar en vävnadsmikro som är känd för att ha tumörbärande effekter samt effekter läkemedlets effektivitet.
För att lösa detta problem, vi genererade en 3D-tumörmodell baserad på en biologisk byggnadsställning som kallas SISmuc (liten tarm-submukosa + slemhinna) som härrör från en decellulariserad svin jejunum. Därigenom är vävnaden arkitektur och viktiga komponenter i ECM såsom olika gener liksom källaren membranstrukturen bevaras 17. Denna unika egenskap är avgörande för tumörmodell generation karcinom som uppstår från epitel och utgör ca 80% av solida tumörer. Vidare är proliferationshastigheten i vårt vävnadstekniska tumörmodell reducerad jämfört med de artificiellt höga hastigheter som uppnås i 2D kultur. Som spridning är en viktig parameter i bedömningen av läkemedlets effektivitet, är drogtestning aktiverat i vår modell mer liknarvillkor för in vivo tumörer 17.
För att utvärdera potentialen hos vår modell för att förutsäga biomarkör beroende läkemedelseffektivitet korrekt, här presenterar vi data för två olika lungcancercellinjer som skiljer sig i deras EGFR -biomarker status. Denna mutationsstatus har börjat bestämmas rutinmässigt i icke-småcellig lungcancer patienter. Riktade behandlingar med TKI såsom EGFR -hämmare gefitinib mot tumörer som bär en aktiverande EGFR-mutation visar överlägsna resultat jämfört med dem med platinabaserad kemoterapi 18-21.
Vi etablerade flera avläsnings tekniker som är relevanta för att utvärdera förening effekt. Vidare efter TGF-beta-1-stimulering har vi möjlighet att undersöka sammansatta insatser i tumörceller som startade EMT processen, som tros vara ett viktigt steg i malign transformation 22,23 och som är ansluten till läkemedels resistance 24.
3D-tumörmodellen möjligt att övervaka cellspecifika svar på riktade behandlingar, kemoterapi eller läkemedelskombinationer med bra kontraster. För att ytterligare förbättra och påskynda läkemedelsscreening och att möta motstånd, detta kompletteras med en in silico simulering. Baserat på några experiment, kan tumörsvar förutsägas in silico om resultatet för ett komplett utbud av läkemedel och kombinationer av dessa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har etablerat en kombinerad in vitro / in silico tumör testsystem för biomarkörer styrd behandlings förutsägelser. Den in vitro-modell utvärderar olika viktiga aspekter av sammansatta åtgärder såsom förändringar av tumörcellproliferation och apoptos på ett specifikt mutations bakgrund som även kan simuleras in silico 17. Här presenterar vi det standardiserade protokoll för 3D-tumörmodellen generation och förening testning inklusive kvantifiering av proliferation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning sponsrades av Centrum för tvärvetenskaplig Clinical Research (IZKF, bidrags BD247) av Universitetssjukhuset i Würzburg och Bayern Fit-programmet (som beviljats Heike Walles).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- . . Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , (2013).
- . . BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
