Иммуномагнитного Разделение жировое депо-специфической СЦА1<sup> высокая</sup> Полученные из жировой ткани стволовые клетки (ИСС)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Стволовыми клетками антигена за 1 (СЦА1 или Ly6A / E) был впервые идентифицирован как маркера клеточной поверхности , выраженной гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток 5,6. Стромальные сосудистый фракция (НВФ) из жировой ткани , полученной от мыши жировых депо представляет собой гетерогенную популяцию клеток , состоящих из фибробластов, макрофагов, эндотелиальных клеток сосудов, нервные клетки и клетки – предшественники адипоцитов 7. Клетки – предшественники адипоцитов, или полученные из жировой ткани стволовые клетки (ASCs) не являются липидами клетки , которые находятся в коллагеновой богатых периваскулярного внеклеточного матрикса (ECM) 8. Около 50% СФДВ состоят из ИСС, которые характеризуются как LINEAGE-отрицательной (Lin -) и CD29 + CD34 +:: СЦА1 + 9. Большинство из этих ячеек являются СЦА1 +: CD24 – адипоцитов клетки – предшественники, которые способны к дифференциации адипоцитов в пробирке; Однако, только часть клеток (0,08% от SVF) составляет СЦА1 <sвверх> +: CD24 + клетки , которые в полной мере способны пролиферировать и дифференцироваться в адипоциты в условиях , в естественных условиях 9. Несмотря на потенциальную предостережением использования СЦА1 + SVF , не различая CD24 + клеток из CD24 – клетки, изолируя СЦА1 + ИСС из жировых депо с использованием иммуномагнитный разделения клеток является эффективным и практичным подходом для определения клеточно-автономной фенотип клеток – предшественников первичных адипоцитов.
В области ожирения и диабета, фиброза тканей и воспаления играют решающую роль в развитии и поддержании диабета 3 2- го типа. В последнее время , Токунага и др. показали , что высокие СЦА1 клетки , выделенные из паховая (или подкожно, SQ) и perigonadal (или висцеральный, VIS) C57BL6 / J жировых отложениях имеют разные подписи генов и ECM ремоделирования в пробирке 10. ММР14 (МТ1-ММР), прототипическим член мембранно-Tип семейства металлопротеиназ матрицы (ММР) опосредует развитие белой жировой ткани (WAT) через его коллагенолитического деятельности 1.
Примеры экспериментов , которые могут проводиться с клетками , выделенными и обогащенных по следующему протоколу включают трехмерную культуру, исследования дифференциации, анализы деградации коллагена и РНК последовательности 10,11. Деградация анализы следует проводить с кислотой экстрагируют коллагена , чтобы обеспечить сохранение телопептидом 11,12. Следующий протокол продемонстрирует методы для выделения первичных сосудистых стромальных клеток из различных жировых депо и обогащения клеток-предшественников адипоцитов с использованием иммуномагнитный разделения клеток. Справедливость сортировки клеток будет оцениваться с проточной цитометрии и путем использования СЦА1-GFP мышей , которые выражают GFP в СЦА1 + клеток, движимый СЦА1 промотора 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем изоляцию и иммуномагнитный разделение клеток мышиных ИСС от различных жировых отложений и их использование для проведения экспериментов в лабораторных условиях . Представленный метод эффективен для быстрого выделения большого количества СЦА1-положитель?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIH DK095137 (к THC). Мы благодарим текущих и бывших членов лаборатории, которые внесли вклад в развитие и сложности описанных способов.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
