A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup> alta</sup> células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Stem antigénio da célula 1 (Sca1 ou Ly6A / E) foi pela primeira vez identificado como um marcador de superfície celular expressa por hematopoiéticos e células estaminais mesenquimais 5,6. A fracção do estroma vascular (SVF) de tecido adiposo obtidas a partir de depósitos de gordura do rato é uma população heterogénea de células compreendendo de fibroblastos, macrófagos, células endoteliais vasculares, células neuronais, adipócitos e células progenitoras 7. Células progenitoras de adipócitos, ou células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) são células não-lípidos carregados que residem na matriz extracelular rica em colagénio perivascular (ECM) 8. Aproximadamente 50% de SVF consistem de ASC, os quais são caracterizados como linhagem negativa (Lin -) e CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. A maior parte destas células são Sca1 +: CD24 – progenitores de adipócitos, que são capazes de diferenciação de adipócitos in vitro; no entanto, apenas uma fracção das células (0,08% de SVF) constitui Sca1 <saté> +: CD24 + células que são totalmente capazes de proliferar e se diferenciar em adipócitos nas condições in vivo 9. Apesar do potencial ressalva de usar Sca1 + SVF sem discriminar células CD24 + de CD24 – células, isolando Sca1 + ASC de depósitos de gordura, através de separação de células imunomagn�ica é uma abordagem eficiente e prático para determinar o fenótipo de células-autônoma de células progenitoras adipócitos primário.
No campo da obesidade e da diabetes, fibrose tecidual e a inflamação desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na manutenção de diabetes Tipo 3-2. Recentemente, Tokunaga et al. mostraram que células de alta SCA1 isoladas de inguinal (ou subcutânea, SQ) e perigonadal (ou visceral, VIS) C57BL6 / J depósitos de gordura apresentam diferentes assinaturas genéticas e ECM remodelação in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), um membro prototípico da membrana-tipo metaloproteinase de matriz (MMP) da família medeia o desenvolvimento de tecido adiposo branco (WAT) através da sua actividade colagenolítica 1.
Exemplos de ensaios que podem ser realizados com as células isoladas e enriquecidas por meio do seguinte protocolo incluem cultura tridimensional, os estudos de diferenciação, os ensaios de degradação de colagénio, e a sequenciação de ARN 10,11. Ensaios de degradação deve ser conduzida com colágeno extraído-ácido para garantir a preservação da telop�tido 11,12. O protocolo a seguir irá demonstrar os métodos para isolar células estromais vasculares primárias de diferentes depósitos de gordura e enriquecer as células progenitoras adipócitos usando separação de células imunomagn�ica. A validade da separação de células será avaliada com citometria de fluxo e através da utilização de ratinhos Sca1-GFP que expressam GFP em células Sca1 +, conduzido por um promotor Sca1 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui demonstramos o isolamento e separação de células imunomagnética de ASC de murino a partir de diferentes camadas de gordura e o seu uso em experiências in vitro. O método apresentado é eficaz para o isolamento rápido de um grande número de ASC SCA1-positivo, o que é vantajoso sobre o isolamento tecnicamente complexo e caro mediada por FACS de ASC 9,14. Ao contrário de FACS, a separação imunomagnética célula não permite a utilização de antigénio múltiplos para a identificação…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIH DK095137 (de THC). Agradecemos aos membros do laboratório atuais e antigos que contribuíram para o desenvolvimento e sofisticação dos métodos descritos.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
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