التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

كاليفورنيا ²⁺ هو أيون المهم جدا وجدت في وفرة في كل خلية واحدة في الجسم. لها أدوار هامة في العديد من الوظائف الخلوية المختلفة، بما في ذلك النمو والانتشار، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج ^1-4. ومن الثابت أن الكالسيوم ²⁺ يمكن أن تؤثر هذه العمليات سواء من خلال الإجراءات المباشرة وغير المباشرة، وبالتالي، يمكن أن التغييرات في تركيزات داخل الخلايا العادية من هذا أيون تؤدي بسهولة إلى نتائج سلبية على الخلايا المتضررة. يعتبر ريال كأكبر الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ مخزن داخل الخلية ^5. تتم المحافظة على مستوى الولاية ثابتة من الكالسيوم ²⁺ في كل من ريال والسيتوبلازم عادة من خلال تغير مستمر داخل وخارج كا ²⁺ -transporting قنوات هذه العضية. وترتبط ظروف ضاغطة المفروضة على الخلايا الناتجة عن أي شكل من أشكال الإصابة أو المرض عادة مع تغييرات كبيرة في ريال كا ²⁺ التي تذهب على أن يكون لها تأثيرات طويلة الأمد على أنهalth للخلية. في أشد الحالات، وعدم قدرة خلية أكد لاستعادة والحفاظ على حالة الاستقرار ريال كا ²⁺ مستويات قد تتوج حتى في الموت موت الخلايا المبرمج ^6-8.

الأبحاث الحالية إلى الخلوية الكالسيوم ²⁺ ديناميات محدودة بسبب حقيقة أن اختبار عدد قليل من الدراسات العضيم الكالسيوم ²⁺ المحتوى المخزن مباشرة ^9-11. الممارسة الأكثر شيوعا بدلا من ذلك ينطوي على قياس هيولي مستويات الكالسيوم ²⁺ كما القياسات غير المباشرة للتغيرات في ريال كا ²⁺ محتوى ^12-14. في هذه التجارب، كاليفورنيا ²⁺ التي يسببها عادة يتم الافراج عن ريال من خلال استخدام وكلاء الدوائية مما تسبب في استنزاف العضية (على سبيل المثال thapsigargin). ثم يتم استخلاص استنتاجات فيما يتعلق تغييرات على ريال كا ²⁺ على أساس التقلبات في هيولي تركيزات الكالسيوم ^2+. وعلى الرغم من القدرة المتبقية للمحققين لرسم هذه الاستنتاجات في أماه دوارnner، وهذه الطريقة من قياس ريال كا ²⁺ بشكل واضح بطريقة غير مباشرة إلى جمع مثل هذه المعلومات، مع الكثير من القيود المتعلقة بتفسير البيانات التي تم جمعها. من أجل تجاوز هذا القيد واضح، فمن الضروري لقياس كمية من الكالسيوم ²⁺ وجدت مباشرة داخل الشبكة اللمعية ريال.

حيوية في النتيجة النهائية لتكون قادرة على تسجيل مباشرة داخل اللمعة ريال مستويات الكالسيوم ²⁺ هي أدوات زراعة الخلايا ومؤشر الكالسيوم ²⁺ المستخدمة. للبيانات المشار إليها في المخطوطة الحالية، من المهم أن نلاحظ أن VSMCs المستخدمة جاءت من خط الخلايا المجمدة. كانت الخلايا المزروعة في المتوسط ​​التعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) + 10٪ مصل العجل (سي إس) عبر الممرات 22-26 لالتجارب المذكورة، المحتضنة في ثابت 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ العرض. باستخدام الطريقة الحالية، على سبيل المثال، قد نمت الخلايا بنجاح كبير على خليط من البروتين الذي يحاكي خارج الخليةالبيئة من العديد من أنواع مختلفة من الأنسجة ^(15). هام للنجاح على طول الوريد ريال كا ²⁺ البحث هو نوع من خليط من البروتين المستخدمة؛ في هذه الحالة، كانت منخفضة عامل النمو متنوعة اللازمة لتجنب مكونات هذه الأداة من التأثير على العادية الكالسيوم ²⁺ الإشارات والحركات التي تحدث باستمرار داخل الخلايا التي تم اختبارها. في أعقاب النمو الناجح للخلايا اختبار، ويجب أيضا أن قدم مؤشر الكالسيوم ²⁺ بفعالية لهذه الخلايا المستزرعة. وقد أصبح هذا ممكنا باستخدام ناقلات الفيروسة الغدانية الذي يحمل ²⁺ مؤشر D1SR الكالسيوم المقيمين ريال. لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن عالية، ويجب أن تكون المحتضنة الخلايا مع ناقلات فيروسية ل36-48 ساعة على الأقل قبل التصوير. هذا المستحضر يوفر أداة موثوقة لقياس الكالسيوم ²⁺ العابرين داخل تجويف ريال مع دقة عالية والتكاثر.

مؤشر D1SR المستخدمة في هذا البروتوكول هو البديل معدلة من D1ER الكالسيوم ²⁺ طndicator الذي تم إنشاؤه في الأصل من قبل مختبر الدكتور روجر تسيان في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية ^9،16. وD1ER الأصلي ينتمي إلى الجيل الثاني من المشفرة وراثيا مؤشرات الكالسيوم ²⁺ دعا cameleons التي تعرض الحساسيات الكالسيوم ²⁺ على نطاق أوسع من ذلك بكثير (0،5 حتي 160 ميكرومتر) بالمقارنة مع الكالسيوم ²⁺ المؤشرات السابقة ^9،16. وD1SR البديل الجديد، هدية عينية من الدكتور واين تشن (جامعة ألبرتا، كندا)، ومع ذلك، يحمل تسلسل كالسيكويسترين متحولة (بدلا من تسلسل calreticulin كما في D1ER الأصلي). وكالسيكويسترين متحولة وخفض ملزم لكا ²⁺ أن يلغي قضية تتنافس مع كالسيكويسترين الذاتية في الربط إلى الكالسيوم ²⁺ داخل التجويف ريال ^11. مؤشر D1SR يحمل اقتطاع تعزيز السماوي ببروتين (CFP) والبروتين أصفر فلوري (YFP) التي تربط بواسطة بروتين رابط يحتوي كالمودولين المعدلة (CAM) وM13 (رانه الببتيد 26 عاما بقايا من الميوسين كيناز ضوء سلسلة التي تربط لكام) متواليات. تم تعديل تسلسل كام M13 لمنع M13 من الربط إلى كالمودولين الذاتية. أيضا، لضمان الاحتفاظ ريال، تمت إضافة تسلسل كالسيكويسترين في نهاية 5'من CFP ^11. وعندما يرتبط الكالسيوم ^2+، يذهب المجال كام M13 من خلال التغييرات متعلق بتكوين التي تؤدي إلى زيادة في نقل الطاقة بين CFP المرافقة وYFP، والتي يتم تسجيلها على أنها زيادة في كثافة إشارة الحنق. من ناحية أخرى، عندما ينخفض ​​تركيز الكالسيوم ريال اللمعية ^2+، يذهب المجال كام M13 من خلال التغييرات متعلق بتكوين العكسية، مما أدى إلى انخفاض في نقل الطاقة بين CFP المرافقة وYFP، وانخفاض كبير في الحنق كثافة إشارة .

Protocol

بيان الأخلاق: أجريت جميع التجارب والإجراءات بالاتفاق مع المبادئ التوجيهية مختبر السلامة الأحيائية التابع لجامعة كولومبيا البريطانية في فانكوفر، كندا. 1. إعداد أطباق 35 ملم الثقافة زجاج القاع للمتحد البؤر المجهري القائم الحنق، <ol style=";text-align…

Representative Results

ويوفر هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام الطريقة الموصوفة لالتقاط البيانات تركيز الكالسيوم 2+ اللمعية ريال سعودي، مقارنة مع الطريقة المستخدمة عادة لقياس غير مباشر تغييرات على العضيم الكالسيوم 2+ تركيزات مخزن من ?…

Discussion

يصف هذا البروتوكول ترنسفكأيشن من VSMCs مع اتش D1SR لدراسة الكالسيوم ²⁺ تركيزات داخل تجويف ريال. وتسمح هذه الطريقة لقياس المباشر من الكالسيوم ²⁺ ضمن هذه العضية وكذلك حركتها إلى / من ريال نتيجة لتطبيق مختلف وكلاء الحركة الكالسيوم. هذا الأسلوب لديه العديد من المزا?…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.