Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l'intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ²⁺ est un ion très important qu'on trouve en abondance au sein de chaque cellule dans le corps. Il a un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires différentes, y compris la croissance, la prolifération, la migration et l' apoptose ^1-4. Il est bien établi que le Ca ²⁺ peut affecter ces processus à travers les deux actions directes et indirectes, et par conséquent, les modifications des concentrations intracellulaires normales de cet ion peut facilement aboutir à des résultats négatifs pour les cellules affectées. Le SR est considéré comme la plus grande concentration intracellulaire de Ca ²⁺ magasin dans la cellule ^5. Les niveaux de l' état ​​d' équilibre de Ca ²⁺ tant dans le SR et le cytoplasme sont normalement maintenus grâce à un flux constant dans et hors des canaux Ca ²⁺ -transporting de cet organite. Les conditions stressantes imposées sur les cellules en raison de toute forme de blessure ou de maladie sont généralement associées à des changements significatifs dans SR Ca ²⁺ qui vont sur ​​d'avoir des effets à long terme sur l'ilalth de la cellule. Dans la plus grave des cas, l'incapacité d'une cellule souligné de récupérer et de maintenir l' état ​​d' équilibre SR Ca ²⁺ niveaux peuvent même aboutir à la mort par apoptose ^6-8.

Les recherches actuelles sur cellulaires Ca ²⁺ dynamique est limitée par le fait que quelques tests d'études organite le contenu de la mémoire ^de Ca directement ^9-11. La pratique la plus courante consiste à la place de la mesure cytoplasmiques ^Ca2 niveaux comme des mesures indirectes des changements dans SR Ca ²⁺ contenu ^12-14. Dans ces expériences, le Ca ²⁺ est généralement amené à être libéré du SR grâce à l'utilisation d'agents pharmacologiques provoquant la diminution de l'organelle (par exemple , la thapsigargine). Les conclusions sont ensuite tirées à l' égard des modifications apportées à SR Ca ²⁺ basé sur les fluctuations des cytoplasmiques ^Ca2 concentrations. Malgré la capacité restante pour les enquêteurs de tirer de telles conclusions dans un rond-point manner, cette méthode de mesure ^de SR Ca est clairement un moyen indirect de glaner ces informations, avec de nombreuses limitations concernant l'interprétation des données recueillies. Afin de contourner cette restriction claire, il est nécessaire de mesurer la quantité de Ca ²⁺ trouvé directement dans le réseau luminal SR.

Vital pour le résultat final d'être en mesure d'enregistrer directement intraluminaux SR Ca ²⁺ niveaux sont les outils de culture cellulaire et l'indicateur Ca ²⁺ utilisé. Pour les données référencées dans le manuscrit en cours, il est important de noter que les CMLV utilisées provenaient d'une lignée de cellules congelées. Les cellules ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum de veau nouveau – né (NCS) au- dessus des passages 22-26 pour les expériences décrites, mises en incubation à une température constante de 37 ° C avec 5% de CO ₂ d' alimentation. En utilisant la méthode courante, par exemple, les cellules ont été cultivées avec succès sur un mélange de protéines extracellulaires qui simule lal' environnement d' un grand nombre de différents types de tissus ^15. Important pour le succès le long de la veine de SR ^{Ca2 +} recherche est le type de mélange de protéines utilisé; dans ce cas, une faible variété de facteur de croissance est nécessaire pour éviter que des composants de cet outil d'affecter la signalisation régulière Ca ²⁺ et les mouvements se produisant constamment dans les cellules testées. Après une croissance réussie de cellules de test, l'indicateur de ^{Ca2 +} doit également être efficacement introduit dans ces cellules en culture. Ceci est devenu possible grâce à l' utilisation d' un vecteur adenoviral qui porte le SR-résident ^{Ca2 +} indicateur D1SR. Pour parvenir à une haute efficacité de transfection, les cellules doivent être mises en incubation avec des vecteurs viraux pendant au moins 36 à 48 heures avant l'imagerie. Cette préparation fournit un outil fiable pour mesurer Ca ^{2 +} transitoires dans la lumière SR avec une grande précision et la reproductibilité.

Indicateur D1SR utilisé dans ce protocole est une variante modifiée du D1ER Ca ²⁺ indicateur qui a été créé à l' origine par le laboratoire du Dr Roger Tsien à l'Université de Californie, San Diego, Etats – Unis ^9,16. La D1ER originale appartient à une deuxième génération de génétiquement codés Ca ²⁺ indicateurs appelés caméléons qui affichent Ca ^de sensibilités sur une gamme beaucoup plus large (0,5 à 160 uM) par rapport aux précédentes Ca ²⁺ indicateurs ^9,16. La nouvelle variante D1SR, un cadeau genre du Dr Wayne Chen (Université de l'Alberta, Canada), cependant, porte une séquence de calséquestrine mutant (au lieu d'une séquence de calréticuline comme dans le D1ER original). Le calséquestrine mutant a une liaison réduite à Ca ²⁺ qui élimine la question de la concurrence avec calséquestrine endogène dans la liaison à Ca ²⁺ dans le SR lumen ^11. L'indicateur de D1SR porte une cyan améliorée tronquée protéine fluorescente (PCP) et de la protéine fluorescente jaune (YFP) qui se lient par une protéine de liaison contenant la calmoduline modifiée (CaM) et M13 (til peptide 26-résidu de la myosine chaîne légère kinase qui se lie à CaM) séquences. La séquence CaM-M13 a été modifiée pour empêcher M13 de se lier à la calmoduline endogène. En outre, pour assurer une rétention SR, une séquence calséquestrine a été ajoutée à l'extrémité 5 'de la PCP ^11. Lorsqu'il est lié à Ca ^2+, le domaine CaM-M13 passe par des changements conformationnels qui se traduisent par une augmentation du transfert d'énergie entre la PCP et d' accompagnement YFP, qui est enregistré comme une augmentation de l'intensité du signal FRET. D'autre part, lorsque la concentration de SR luminal Ca ²⁺ gouttes, le domaine CaM-M13 passe par des changements conformationnels inverse, ce qui entraîne une diminution du transfert d'énergie entre la PCP et d' accompagnement YFP, et une baisse significative de FRET intensité du signal .

Protocol

déclaration éthique: Toutes les expériences et les procédures ont été menées en accord avec les lignes directrices de biosécurité en laboratoire de l'Université de la Colombie-Britannique, Vancouver, Canada. 1. Préparation de 35 plats Culture mm à fond de verre pour base de FRET Microscopie confocale Préparer des plaques en utilisant la procédure suivante 36-48 h avant les expériences. Récupérez mélange de protéines gélatineuse choisi et 0,25% de trypsine-EDTA de -20 …

Representative Results

Cette section fournit des exemples des résultats qui peuvent être obtenus en utilisant la méthode décrite pour capturer SR luminal Ca2 données de concentration, par rapport à la manière couramment employée de mesurer indirectement les changements à organites les concentrations de magasin de Ca en observant les fluctuations cytoplasmique Ca 2+ . La figure 1A montre un i…

Discussion

Ce protocole décrit la transfection de CMLV avec l'adénovirus D1SR pour étudier les concentrations de ^{Ca2 +} dans la lumière du SR. Cette méthode permet la mesure directe de ^{Ca2 +} à l'intérieur de cet organite, ainsi que son mouvement vers / hors de la RS à la suite de l'application de différents agents de calcium en mouvement. Cette méthode présente de nombreux avantages pour les chercheurs qui travaillent à une compréhension globale de la façon dont les changements à SR …

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.