De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ^{2 +} es un ion muy importante que se encuentra en abundancia dentro de cada célula en el cuerpo. Tiene un papel importante en muchos diferentes funciones celulares, incluyendo el crecimiento, la proliferación, la migración y apoptosis ^1-4. Está bien establecido que el Ca ²⁺ puede afectar a estos procesos a través de ambas acciones directas e indirectas, y por lo tanto, los cambios en las concentraciones intracelulares normales de este ion puede dar lugar fácilmente a resultados negativos para las células afectadas. La SR se considera como el más grande ²⁺ tienda intracelular de Ca en la célula ^5. Niveles de estado estacionario de Ca2 ^+, tanto en el SR y el citoplasma normalmente se mantienen a través de un flujo constante dentro y fuera de los canales ^{de Ca2 +} -transporting de este orgánulo. Las condiciones de estrés impuestas a las células debido a cualquier tipo de lesión o enfermedad se asocian con cambios significativos en la SR ^{Ca2 +} que pasan a tener efectos duraderos en la queALTH de la célula. En el más grave de los casos, la incapacidad de una célula subrayado para recuperar y mantener Ca SR estado estacionario ²⁺ niveles incluso pueden culminar en la muerte por apoptosis ^6-8.

La investigación actual en celulares Ca ²⁺ dinámica está limitada por el hecho de que pocos estudios orgánulo prueba de Ca ²⁺ del contenido del almacén directamente ^9-11. La práctica más común en cambio consiste en la medición de los niveles ^{de Ca2 +} citoplasmáticos como mediciones indirectas de los cambios en el contenido de SR Ca2 ^{+ 12-14.} En estos experimentos, Ca ²⁺ se induce comúnmente para ser liberado de la SR a través del uso de agentes farmacológicos que causan el agotamiento de los orgánulos (por ejemplo, thapsigargin). Conclusiones son extraídas con respecto a los cambios SR Ca2 ⁺ en base a las fluctuaciones en las concentraciones ^de Ca ²⁺ citoplásmicos. A pesar de la capacidad restante para los investigadores extraer las conclusiones en una rotonda manner, este método de medición SR Ca2 ⁺ es claramente una forma indirecta de recoger dicha información, con muchas limitaciones relativas a la interpretación de los datos recogidos. Con el fin de evitar esta restricción clara, es necesario medir la cantidad de Ca ²⁺ se encuentra directamente dentro de la red luminal SR.

Vital para el resultado final de ser capaz de grabar directamente SR niveles intraluminales ^{de Ca2 +} son las herramientas de cultivo celular y el indicador de Ca ²⁺ utilizado. Para los datos de referencia en el manuscrito actual, es importante señalar que CMLV utilizados procedían de una línea celular congelada. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero de ternero recién nacido (NCS) sobre pasajes 22-26 para los experimentos descritos, se incubaron a una constante de 37 ° C con 5% de CO ₂ de suministro. Utilizando el método actual, por ejemplo, las células han sido cultivadas con mucho éxito en una mezcla de proteínas que simula el extracelularentorno de muchos tipos diferentes de tejidos ^15. Importante para el éxito a lo largo de la vena de la SR Ca ²⁺ investigación es el tipo de mezcla de proteína utilizada; en este caso, una variedad bajo factor de crecimiento era necesario para evitar componentes de esta herramienta de afectar a la señalización normal ^de Ca2 ⁺ y movimientos que se producen constantemente dentro de las células de la prueba. Tras el crecimiento con éxito de células de ensayo, el indicador de Ca ^{2 +} también se debe introducir de manera efectiva a estas células cultivadas. Esto ha sido posible mediante el uso de un vector adenoviral que lleva el SR-residente Ca ²⁺ D1SR indicador. Para lograr una alta eficiencia de la transfección, las células deben ser incubadas con vectores virales durante al menos 36 a 48 horas antes de la formación de imágenes. Esta preparación proporciona una herramienta fiable para medir Ca ^{2 +} transitorios dentro de la luz SR con alta precisión y reproducibilidad.

D1SR indicador utilizado en este protocolo es una variante modificada del D1ER Ca2 ⁺ indicator que fue creado originalmente por el laboratorio del Dr. Roger Y. Tsien en la Universidad de California, San Diego, EE.UU. ^9,16. El D1ER original, pertenece a una segunda generación de codificados genéticamente Ca ²⁺ indicadores llamados cameleons que muestran sensibilidades Ca ^{2 +} a través de una gama mucho más amplia (0,5 a 160 mM) en comparación con anteriores Ca ²⁺ indicadores ^9,16. La nueva variante D1SR, una especie de regalo del Dr. Wayne Chen (Universidad de Alberta, Canadá), sin embargo, lleva una secuencia mutante calsecuestrina (en lugar de una secuencia calreticulina como en el D1ER original). El calsecuestrina mutante tiene una reducida unión a Ca2 ⁺ que elimina el problema de competir con calsecuestrina endógena en la unión a Ca2 ⁺ dentro del lumen ¹¹ SR. El indicador D1SR lleva una proteína fluorescente cian truncada mejorado (CFP) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) que se unen por una proteína de unión que contiene calmodulina modificado (CaM) y M13 (tél péptido de 26 restos de la miosina de cadena ligera quinasa que se une a secuencias CAM). La secuencia de CaM-M13 ha sido modificado para evitar M13 de la unión a calmodulina endógeno. Además, para asegurar la retención de SR, una secuencia calsecuestrina se ha añadido en el extremo 5 'de la PPC ^11. Cuando se une a Ca ^{2 +,} el dominio CaM-M13 pasa a través de cambios conformacionales que resultan en un aumento en la transferencia de energía entre la PPC y que flanquean YFP, que se registra como un aumento en la intensidad de la señal de FRET. Por otro lado, cuando la concentración de SR Ca ^{2 +} luminal gotas, el dominio de CaM-M13 pasa a través de cambios conformacionales inversa, lo que resulta en una disminución en la transferencia de energía entre la PPC y YFP flanqueantes, y una caída significativa en la intensidad de la señal FRET .

Protocol

declaración de la ética: Todos los experimentos y los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de Bioseguridad en el Laboratorio de la Universidad de British Columbia, Vancouver, Canadá. 1. Preparación de placas de cultivo de 35 mm con fondo de cristal para Microscopía Confocal basados ​​en FRET Preparar las placas mediante el siguiente procedimiento hr 36-48 antes de los experimentos. Recuperar mezcla de proteína gelatinosa elegido y 0,25% de tripsina-EDTA …

Representative Results

Esta sección proporciona ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el método descrito para capturar Ca 2+ datos de concentración luminal SR, en comparación con la forma comúnmente empleado para medir indirectamente cambios a orgánulos Ca 2+ concentraciones de tienda mediante la observación de las fluctuaciones en citoplasmática de Ca2 + . La Figura 1A<…

Discussion

Este protocolo describe la transfección de CMLV con el adenovirus D1SR para estudiar las concentraciones de ^{Ca2 +} en el lumen de la SR. Este método permite la medición directa de Ca ²⁺ dentro de este orgánulo, así como su movimiento en / fuera de la SR como resultado de la aplicación de diferentes agentes de calcio en movimiento. Este método tiene muchas ventajas para los investigadores que trabajan hacia una comprensión global de cómo los cambios en los niveles de SR y citoplásmicos Ca <…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.