Extracellulaires enregistrement de l'activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake
Summary
We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
Abstract
Les différences dans l'activité des neurotransmetteurs et neuromodulateurs, et par conséquent différentes réponses neuronales, peut être trouvée entre les animaux anesthésiés et éveillés. Par conséquent, des méthodes permettant la manipulation des systèmes synaptiques chez les animaux éveillés sont nécessaires afin de déterminer la contribution des entrées synaptiques pour le traitement neuronal affecté par les anesthésiques. Ici, nous présentons une méthodologie pour la construction d'électrodes pour enregistrer simultanément l'activité neuronale extracellulaire et libèrent des substances neuroactives multiples au voisinage des sites d'enregistrement des souris éveillées. En combinant ces méthodes, nous avons effectué des injections de microiontophoretic gabazine pour bloquer sélectivement les récepteurs GABA A dans les neurones de colliculus inférieur des souris frontales retenue. Gabazine modifié avec succès des propriétés de réponse neuronaux tels que la zone de réponse en fréquence et adaptation spécifique stimulus. Ainsi, nous démontrons que nos méthodes sont appropriées pour recording activité d'une seule unité, et pour disséquer le rôle des récepteurs spécifiques de neurotransmetteurs dans le traitement auditif.
La principale limitation de la procédure décrite est le temps d'enregistrement relativement courte (~ 3 h), ce qui est déterminé par le niveau d'accoutumance de l'animal à des sessions d'enregistrement. D'autre part, plusieurs sessions d'enregistrement peuvent être réalisées dans le même animal. L'avantage de cette technique par rapport à d'autres procédures expérimentales utilisées pour manipuler le niveau de neurotransmission ou neuromodulation (par exemple sous forme d'injections systémiques ou l'utilisation de modèles optogénétiques), est que l'effet du médicament est confinée aux entrées synaptiques locales au neurone cible. En outre, l'usage, la fabrication d'électrodes permet un réglage de paramètres spécifiques en fonction de la structure neuronale et le type de neurone d'intérêt (telles que la résistance de pointe pour améliorer le rapport signal sur bruit des enregistrements).
Introduction
L'interaction de l' excitation neuronale et l' inhibition est fondamentale pour le traitement de l' information sensorielle 1. Il est également connu que l' anesthésie a un fort impact sur la dynamique de l' activation corticale et la structure temporelle des entrées synaptiques 2,3. Par exemple, il a été observé que les anesthésiques modifient la durée des réponses visuelles évoquées dans les neurones corticaux 3,4. En outre, le rapport entre excitateurs et entrées synaptiques inhibitrices est différent chez les animaux anesthésiés et éveillés 4,5, modifiant à la fois évoqués et les taux d'activité spontanée 6,7. En mesurant les conductances synaptiques, Haider et ses collègues 4 ont trouvé que l' inhibition appariés excitation en amplitude sous anesthésie alors que pendant l' éveil, l' inhibition était plus forte que l' excitation. Ces résultats incitent le développement de procédures expérimentales pour étudier l'impact des entrées synaptiques spécifiques sur le traitement sensoriel chez les animaux éveillés.
<p class = "jove_content"> L'éjection contrôlée de substances neuroactifs chargées en appliquant de petites injections de courant (de l'ordre de nA) a été largement utilisée pour étudier la contribution des entrées synaptiques et le rôle des récepteurs cellulaires putatifs dans le traitement sensoriel 8-13 . Cette technique, connue sous le nom microiontophorèse, permet l'application de médicaments dans le voisinage du neurone enregistré, ce qui contribue à un effet rapide et confiné. Cette procédure est plus approprié pour étudier les effets locaux des substances neuroactives, par rapport à l'effet généralisée provoquée par d'autres manipulations expérimentales telles que les injections systémiques, microdialyse ou l'utilisation de techniques optogénétiques. Habituellement, une configuration d'électrode ferroutage 14,15 est utilisé pour enregistrer simultanément le neurone cible et de livrer les substances neuroactifs d'intérêt. Il se compose d'une électrode d'enregistrement fixé à une pipette de multibarrel qui transporte les substances neuroactives. Modifications de l'oprocédure riginal décrite par Havey et Caspary 14 ont été mis en œuvre. Par exemple, une électrode en tungstène, au lieu d'un verre, peut être utilisé pour enregistrer l'activité neuronale 16. Méthodes publiées précédemment pour la fabrication d'électrodes de tungstène 17,18 comportent trois étapes générales: gravure électrolytique de pointes de fil de tungstène, l' isolation en verre, et l' ajustement de l'exposition de pointe pour répondre aux exigences d'enregistrement.Un champ intéressant et émergente en neurosciences auditive est l'étude de l' adaptation spécifique à stimulus (SSA 19). SSA est une diminution spécifique de la réponse neurale aux sons répétitifs qui ne généralisent pas à d'autres sons rarement présentés. L'importance de l' ASS réside dans son rôle potentiel comme un mécanisme neuronal de détection de déviation sous – jacente dans le cerveau auditif, ainsi que d' une éventuelle corrélation neuronale pour la composante non – concordance de la négativité tardive du potentiel évoqué auditif 20,21. SSA occurs de l'IC jusqu'au cortex auditif 19,22-24. GABA A l' inhibition médiée a été démontrée à agir en tant que mécanisme de contrôle de gain sur SSA 7,16,25, qui a également été montré pour être affectés par l' anesthésie 26. Ici , nous présentons un protocole qui combine les méthodes décrites précédemment pour l' enregistrement de l'activité d'une seule unité de neurones de circuits intégrés avant et pendant l'application d'un antagoniste sélectif des récepteurs ai GABA A chez des souris éveillées. Tout d'abord, nous décrivons la fabrication d'électrodes ferroutage et à côté, les méthodes chirurgicales et d'enregistrement. Pour tester l'efficacité de libération du médicament, nous avons comparé le champ récepteur ainsi que le niveau de SSA des neurones IC avant et pendant l'éjection de microiontophoretic gabazine.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microiontophorèse des substances neuroactifs chez les animaux éveillés est une technique puissante pour sonder et de disséquer le rôle des entrées synaptiques spécifiques sur l'activité des neurones isolés 40,41. Plus important encore, cette procédure permet de déterminer l'impact des neurotransmetteurs et neuromodulateurs sur les circuits neuronaux sans l'interférence potentielle des anesthésiques. Ici, nous démontrons que l'application de gabazine dans le IC de souris éveil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le MINECO accorde BFU201343608-P et PSI2013-49348-EXP, et la subvention SA343U14 JCYL au financement MSM et MRC noyau pour ARP. YAA a tenu une CONACyT (216106) et une bourse septembre
Materials
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
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