We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
Unterschiede in der Aktivität von Neurotransmittern und Neuromodulatoren und folglich verschiedene neuronale Reaktionen können zwischen narkotisierten und wachen Tieren gefunden werden. Daher sind Verfahren ermöglicht die Manipulation von synaptischen Systeme in wach Tiere erforderlich, um den Beitrag der synaptischen Eingaben neuronalen Verarbeitung unbeeinflußt von Anästhetika zu bestimmen. Hier stellen wir Methoden zur Konstruktion von Elektroden gleichzeitig extrazelluläre neuronale Aktivität aufzuzeichnen und mehrere neuroaktive Substanzen freisetzen in der Nähe der Aufzeichnungs Seiten in wach Mäusen. Durch diese Verfahren kombiniert, führten wir microiontophoretic Injektionen von Gabazin selektiv zu GABA – A – Rezeptoren in Neuronen des Colliculus inferior von Kopf-gezügelt Mäuse blockieren. Gabazin erfolgreich Nervenreaktionseigenschaften wie beispielsweise die Frequenzantwortbereich und Stimulusspezifische Anpassung modifiziert. Somit zeigen wir, dass unser Verfahren geeignet sind, recording Single-Unit-Aktivität und für die Rolle der spezifischen Neurotransmitter-Rezeptoren in auditorischen Verarbeitung sezieren.
Die Haupteinschränkung des beschriebenen Verfahrens ist die relativ kurze Aufnahmezeit (~ 3 h), die durch die Höhe der Gewöhnung des Tieres zu den Aufnahmen bestimmt. Auf der anderen Seite können mehrere Aufnahmen in demselben Tier durchgeführt werden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen experimentellen Verfahren verwendet, um das Niveau der Neurotransmission oder Neuromodulation (wie systemische Injektionen oder die Verwendung von optogenetische Modelle) zu manipulieren, ist, dass die Arzneimittelwirkung auf die lokalen synaptischen Eingaben in das Zielneurons beschränkt. Darüber hinaus ermöglicht die kundenspezifische Herstellung von Elektroden Einstellung bestimmter Parameter entsprechend der neuralen Struktur und Art des Neurons von Interesse (beispielsweise der Spitze Widerstand zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis der Aufnahmen).
Das Zusammenspiel von neuronalen Erregung und Hemmung ist von grundlegender Bedeutung für die Verarbeitung von Sinnesinformationen 1. Es ist auch bekannt , dass der Anästhesie einen starken Einfluss auf die Dynamik der kortikalen Aktivierung hat und das zeitliche Muster der synaptischen Eingänge 2,3. Beispielsweise wurde beobachtet , daß Anästhetika die Dauer visuell hervorgerufenen Reaktionen in kortikalen Neuronen 3,4 verändern. Darüber hinaus unterscheidet sich das Verhältnis zwischen erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge in narkotisierten und wachen Tieren 4,5, zu verändern sowohl evozierten und spontanen Aktivitätsraten 6,7. Durch die synaptischen Leitwerte Messung, Haider und Kollegen 4 gefunden , dass die Hemmung abgestimmt Erregung in Amplitude unter Narkose während im Wachzustand, Hemmung stärker als Anregung war. Diese Ergebnisse veranlassen, die Entwicklung von experimentellen Verfahren, die Auswirkungen der spezifischen synaptischen Eingänge auf die sensorische Verarbeitung in wach Tiere zu studieren.
<p class = "jove_content"> Die gesteuerte Ausstoß von geladenen neuro Substanzen durch kleine Strominjektionen Anwendung (in der Größenordnung von nA) wurde ausgiebig verwendet , um den Beitrag der synaptischen Eingänge zu untersuchen und die Rolle der vermeintlichen Zell – Rezeptoren in der sensorischen Verarbeitung 8-13 . Diese Technik, die als microiontophoresis bekannt ist, ermöglicht die Anwendung von Medikamenten in der Nähe des aufgezeichneten neuron, was zu einem schnellen und beschränkte Wirkung beiträgt. Dieses Verfahren ist besser geeignet für lokale Effekte von neuroaktiven Substanzen studiert, im Vergleich zu den weit verbreiteten Effekt durch andere experimentelle Manipulationen, wie systemische Injektionen, Mikrodialyse oder die Verwendung von optogenetische Techniken ausgelöst. Üblicherweise wird eine Huckepack-Elektrodenkonfiguration 14,15 wird verwendet , um gleichzeitig das Ziel Neuron aufnehmen und die neuro Substanzen von Interesse zu liefern. Es besteht aus einer Aufzeichnungselektrode mit einem mehrgehäusigen Pipette angebracht, die die neuroaktiven Substanzen trägt. Abwandlungen der original Verfahren von Havey und Caspary 14 umgesetzt wurden. Beispielsweise eine Wolframelektrode, anstelle einer Glas ein, verwendet werden , um die neuronale Aktivität 16 aufzunehmen. Bisher veröffentlichte Verfahren zur Herstellung von Wolframelektroden 17,18 umfassen drei allgemeine Schritte: elektrolytische Ätzen von Wolfram Drahtspitzen, Glasisolierung, und die Einstellung der Spitze Belichtung , um die Aufnahme Anforderungen erfüllen.Ein interessantes und emergent Feld in auditorische Neurowissenschaften ist die Untersuchung der Stimulus spezifische Anpassung (SSA 19). SSA ist eine spezifische Abnahme der neuronalen Reaktion auf sich wiederholende Geräusche, die nicht auf andere, selten präsentiert Klänge nicht verallgemeinern. Die Bedeutung der SSA liegt in ihrer möglichen Rolle als neuronales Mechanismus zugrunde liegende deviance Detektion im auditorischen Gehirn sowie eine mögliche neuronale Korrelat für die späte Mismatch – Negativität Komponente des Gehör Potential 20,21 evozierte. SSA occurs vom IC bis zum auditorischen Cortex 19,22-24. GABA A -vermittelte Hemmung wurde als Verstärkungssteuerungsmechanismus auf SSA 7,16,25, die auch gezeigt wurde , werden beeinflußt durch Anästhesie 26 einwirken demonstriert. Hier stellen wir ein Protokoll , das für die Aufzeichnung der Single-Unit – Aktivität von IC – Neuronen vor und während der Anwendung eines selektiven Antagonisten der GABA A -Rezeptoren in wachen Mäusen zuvor beschriebenen Verfahren kombiniert. Zunächst beschreiben wir die Herstellung von Huckepack-Elektroden und anderen, den chirurgischen und Aufzeichnungsverfahren. Um die Wirksamkeit der Wirkstofffreisetzung zu testen, verglichen wir die rezeptiven Feld sowie das Niveau der SSA von IC-Neuronen vor und während der microiontophoretic Ausstoß von Gabazin.
Die microiontophoresis von neuroaktiven Substanzen in wachen Tieren ist eine leistungsstarke Technik zur Sonde und die Rolle der spezifischen synaptischen Eingaben auf die Aktivität der einzelnen Neuronen 40,41 sezieren. Noch wichtiger ist, ermöglicht dieses Verfahren die Bestimmung der Auswirkungen der Neurotransmitter und Neuromodulatoren auf neuronale Schaltkreise ohne die mögliche Störung von Anästhetika. Hier zeigen wir , dass die Anwendung von Gabazin in dem IC von wach Mäusen robust die Frequenze…
The authors have nothing to disclose.
Dieses Projekt wurde von der Mineco finanziert gewährt BFU201343608-P und PSI2013-49348-EXP und die JCYL Zuschuss SA343U14 zu MSM und MRC Kernfinanzierung ARP. YAA hielt eine CONACyT (216.106) und SEP-Stipendium.
Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |