Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
diferenciação terminal músculo esquelético começa com o compromisso de células precursoras pluripotentes mesodermais de mioblastos. Estas células ainda tem a capacidade de proliferar ou eles podem se diferenciar e se fundem em miotubos multinucleadas, que maturate ainda mais para formar fibras musculares. diferenciação terminal músculo esquelético é orquestrada pela ação coordenada de vários fatores de transcrição, em particular os membros dos fatores ou MRFs reguladoras muscular (MyoD, miogenina, Myf5 e MRF4), também chamado de bHLH miogênica fatores de transcrição da família. Estes factores cooperar com complexos de remodelação da cromatina dentro da rede reguladora da transcrição elaborada para atingir tecido muscular esquelético. Neste, MyoD é considerado o fator de transcrição miogênica mestre no desencadeamento de diferenciação terminal muscular. Esta noção é reforçada pela sua capacidade de converter MyoD células não musculares em células do músculo esquelético. Aqui nós descrevemos uma abordagem utilizada para identificar MyoDparceiros de proteína de forma exaustiva, a fim de elucidar os diferentes fatores envolvidos na diferenciação terminal músculo esquelético. O objectivo a longo prazo é compreender os mecanismos epigenéticos envolvidos na regulação de genes musculares esqueléticas, ie., Metas MyoD. parceiros MyoD são identificados usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) a partir de um sistema heterólogo acoplada a espectrometria de massa de caracterização (MS), seguido de uma validação do papel de parceiros relevantes durante a diferenciação terminal de músculo esquelético. formas aberrantes de factores miogénicos, ou a sua regulação aberrante, está associada com um número de desordens musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiossarcoma e defeitos na regeneração muscular. Como tal, os factores miog�icas fornecer um conjunto de potenciais alvos terapêuticos em doenças musculares, tanto no que diz respeito aos mecanismos que causam doença em si e os mecanismos regenerativos que pode melhorar o tratamento da doença. Assim, o understan detalhadaDing das interacções intermoleculares e os programas genéticos controlados pelos factores miog�icas é essencial para a concepção racional de terapias eficientes.
Introduction
organismos multicelulares eucarióticos são compostas de diferentes órgãos e tecidos. Cada tecido funcional tem um padrão de expressão do gene específico, o qual é determinado em cada passo de diferenciação. Diferenciação celular envolve a activação de genes específicos, manutenção da sua expressão e, geralmente, o silenciamento de um conjunto de genes tais aqueles que estão envolvidos na proliferação celular. diferenciação de músculo esquelético, ou miogénese, é, assim, um processo multi-etapa, que começa com a determinação de células estaminais mesodermal em mioblastos, e, em seguida, leva à diferenciação terminal destes mioblastos em primeiro mono-nucleadas, e, em seguida, multi-nucleadas, miotubos . Assim, mioblastos são "determinado" células, que ainda são capazes de proliferar, mas eles estão comprometidos com a linhagem músculo esquelético, e, portanto, pode diferenciar exclusivamente em células musculares esqueléticas, quer durante o desenvolvimento embrionário ou em regeneração muscular adulta. O processo de terminal de músculo esquelético diferemciação é orquestrado por um programa genético específico que se inicia com a saída permanente do ciclo celular de células precursoras de mioblastos que leva a um silenciamento definitivo da proliferação de genes associados, tais como E2F genes alvo 1. Com efeito, durante o processo de diferenciação terminal, paragem proliferação de mioblastos é um passo crucial que precede a expressão de genes específicos do músculo esquelético e a fusão de mioblastos em miotubos 2. Tal programa permite que as células-tronco musculares adultas, também chamados de células satélites, para diferenciar durante o processo de regeneração após lesão do músculo esquelético.
Myogenesis mamíferos é criticamente dependente de uma família de miogênica hélice-volta-hélice (bHLH) fatores de transcrição MyoD, Myf5, MRF4 e miogenina, frequentemente referida como a família de fatores esqueléticos determinação muscular ou MRFs (músculo fatores regulatórios) 3. Cada um deles desempenha um papel essencial na especificação e DIFdiferen- das células musculares esqueléticas e tem um padrão de expressão específico abril 05-07. A ativação de Myf5 e MyoD constitui o passo determinante que compromete as células da linhagem miogênica e subsequente expressão de miogenina desencadeia myogenesis com a ativação de genes específicos do músculo esquelético, como MCK (Muscle Creatina Quinase). Factores de transcrição bHLH Miogênica cooperar com os membros da família MEF2 na activação de genes musculares de loci anteriormente silenciosos 8. Eles também estimulam esquelético transcrição do gene muscular como heterodímeros com proteínas bHLH onipresente, E12 e E47, conhecidas como proteínas E, que se ligam chamados E-caixas em várias regiões do gene-regulação 8. Torção, Id (inibidor de diferenciação) e outros factores regulam negativamente este processo, por competir com MyoD para proteínas E de ligação 8.
MyoD é considerado como o jogador mais importante no desencadeamento de terminal muscular diferenciação 9 </s-se> uma vez que tem a capacidade de induzir um programa de determinação miogénica / diferenciação (trans-diferenciação), em muitos sistemas não-musculares completamente diferenciadas 10-13. Na verdade, a expressão forçada de MyoD induz a trans-diferenciação de diferentes tipos celulares, mesmo aqueles derivados de outra origem embriológica 12. Por exemplo, pode converter MyoD hepatócitos, f ibroblastos, melanócitos, neuroblastos e adipocitos em células musculares semelhante. A ação trans-de diferenciação de MyoD envolve uma ativação anormal do programa genético miogênica (nomeadamente os seus genes-alvo) em um ambiente não-muscular, concomitante ao silenciamento do programa genético de origem (nomeadamente, os genes de proliferação).
Em proliferando mioblastos, MyoD é expresso, mas não é capaz de ativar seus genes-alvo, mesmo quando ele se liga aos seus promotores 14-16. Por conseguinte, o requisito de MyoD de ser continuamente expresso em mioblastos indiferenciadas permanece bastante Elusive. MyoD pôde reprimir seus genes-alvo devido ao recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina repressivas em proliferando mioblastos antes do carregamento de ativar cromatina remodelação enzimas 14,17. Por exemplo, na proliferação mioblastos, MyoD está associada com o co-repressor de transcrição KAP-1, histona desacetilases (HDACs) e metiltransferases lisina repressivas (KMTS), incluindo a histona H3 lisina 9 ou H3K9 e H3K27 KMTS, e suprimir de forma activa a expressão de genes alvo através do estabelecimento de uma estrutura de cromatina 14,17 localmente repressivo. Importante, um relatório recente indicou que MyoD é em si directamente metilado pelo H3K9 KMT G9a resultando na inibição da sua actividade de transactivação 16.
Os mecanismos epigenética envolvidas neste trans-diferenciação de células não musculares por MyoD são em grande parte desconhecida. Notavelmente, algumas linhas de células são resistentes a trans-diferenciação induzida por MyoD. Assim, em células HeLa, MyoD é ou inactiva ouainda pode funcionar como repressor, em vez de activador da transcrição devido à falta de expressão da subunidade BAF60C remodelação da cromatina complexo SWI / SNF 18. Este modelo pode, assim, ser de escolha para melhor caracterizar os mecanismos de repressão do gene induzida por MyoD. É igualmente apropriado para ensaiar a capacidade de MyoD para induzir ambiente cromatina repressivo na sua loci alvo com seus parceiros associados e, portanto, desvendar os mecanismos repressivos dependente de MyoD em proliferando mioblastos para afinar a diferenciação terminal.
Aqui descrevemos o protocolo para a identificação de parceiros MyoD usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) acoplada a espectrometria de massa (MS) caracterização. A utilização de células HeLa-S3 que expressam estavelmente Bandeira-HA-MyoD permitida para obter material suficiente para purificar os complexos a partir de extractos nucleares MyoD fraccionados. A identificação de parceiros MyoD no sistema heterólogo foi seguido por validatino em um sistema relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado permite a identificação exaustiva de parceiros de um fator de transcrição, MyoD. Revelou parceiros MyoD num sistema heterólogo resistente a diferenciação induzida por MyoD, nomeadamente células de HeLa-S3. Assim, por definição, MyoD parceiros identificados são expressos ubiquamente. Estes incluem factores gerais e específicos de sequência de transcrição, enzimas modificadoras da cromatina, proteínas de processamento de RNA, quinases (Tabelas 1 e 2).…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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