استهداف بيوفيلم أسوشيتد<em> المكورات العنقودية الذهبية</em> استخدام ريسازورين استنادا الفحص المخدرات-القابلية
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
يمكن الميكروبات المسببة للأمراض تشكل الأغشية الحيوية في الجسم الحي مما يؤدي إلى الالتهابات المزمنة غير الحادة 1. العدوى المرتبطة بيوفيلم هو عامل خطر جدي من الإجراءات الطبية التي تنطوي على زرع أجسام غريبة (على سبيل المثال، استبدال العظام الاصطناعية، ثدي) أو تركيب أنابيب القصبة الهوائية أو القسطرة البولية 2. في هذه السياقات، العلاج المضاد للعدوى هو دائما تقريبا عند الضرورة نادرا ما يتم مسح العدوى القائم على بيوفيلم من تلقاء نفسها، حتى في الأفراد المناعة. المكورات العنقودية الذهبية هي واحدة من مسببات الأمراض الأكثر لوحظ في كثير من الأحيان المتورطين في مضاعفات بيوفيلم التي تحدث أثناء استخدام الأجهزة الطبية الغازية 3.
وللأسف، فإن طبيعة الأغشية الحيوية بمثابة حاجز وقائي يجعلها أكثر مقاومة للعلاج من خلايا العوالق 1،4، وتقييم الفعالية السريرية تنبأ هو جزء هام من كلا الأوليتطوير العقاقير وكذلك مراقبة مقاومة العقاقير. هناك اعتراف متزايد أن الظروف المختبرية، وتركز على ثقافات العوالق، قد لا تمثل بأمانة المرض في العالم الحقيقي 5. مما زاد من تفاقم المشكلة، وتكرار الظواهر بيوفيلم أمر صعب، ونماذج بيوفيلم القائمة ومملة ويعانون من ارتفاع المشترك بين وداخل فحص 6 التباين. وهكذا، كثير من الباحثين، من خلال ضرورة، افتراضية المقايسات خلية العوالق قابلية المخدرات، وبالتالي يحتمل أن إهمال جانب هام من جوانب الفوعة البكتيرية والأمراض.
نحن هنا تصف البروتوكول لمعايرة البكتيريا، وتحديدا س. الذهبية، في الأغشية الحيوية نمت قبل استخدام مقرها 7،8 نظام بيوفيلم جيدا 96. بينما بروتوكول لتشكيل بيوفيلم والتحدي يتبع أساسا على توصية الصانع، ونحن تقديم منهجية غنية بالمعلومات بديلة لقياس جدوى biofILM بعد التحدي. لفترة وجيزة، والبكتيريا يتم تربيتها في لوحة الربط، حيث تشكل الأغشية الحيوية على أوتاد جاحظ تعلق على غطاء لوحة ل. بعد تشكيل بيوفيلم، وانخفض أوتاد بلطف في آبار لوحة جديدة مليئة PBS لإزالة الخلايا العوالق. و-غطاء الوتد، مع الأغشية الحيوية المرفقة، يتم نقلها إلى لوحة التحدي الجديدة، التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية لأن يعاير. بعد الحضانة الثانية، تتم إزالة الأغطية مرة أخرى، وغسلها، ونقله إلى لوحة الانتعاش التي تحتوي على ريسازورين صبغ، حيث يخضع لعملية حضانة النهائية. تحويل ريسازورين يمكن تسجيل حركيا أو اعتباره قراءة نقطة النهاية بعد فترة نقاهة محددة. هذا الأسلوب القائم على صبغ قياس قابلية الأغشية الحيوية يختلف اختلافا كبيرا من كفو (وحدات تشكيل مستعمرة) مملة منهجية قائمة على العد هو موضح في البروتوكول الأصلي 7. OD 600 القياسات من لوحة التحدي المخدرات وريسازورين حركية تحويل بمثابة قابلية القراءةعموميات من العوالق وبيوفيلم الخلايا، على التوالي، وتقدم موثوق بها، فحص سريع، وبسيط من الناحية الفنية الغنية بالمعلومات من أجل البقاء بيوفيلم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، التي وصفناها فحص بيوفيلم المعدلة لتحديد نشاط مثبطات اختبارها على س. الأغشية الحيوية الذهبية التركيز على الدولة التمثيل الغذائي للخلايا بيوفيلم المرتبطة بها. في حين الشروع بيوفيلم وصف وإجراءات تحد توصيات الشركة معظمها تحاكي، واستخدام ريسازورين الصبغ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development – can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror ‘real-world’ pathogenesis?. Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
