Targeting biofilm Associated<em> Staphylococcus aureus</em> Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Summary

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Abstract

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Introduction

Microbi patogeni possono formare biofilm in vivo che portano a infezioni croniche non acute ^1. Infezione biofilm-associata è un grave fattore di rischio di procedure mediche che coinvolgono l'impianto di corpi estranei (ad esempio, la sostituzione di ossa artificiali, le protesi mammarie) o l'installazione di tubi tracheali o cateteri urinari ^2. In questi contesti, terapia anti-infettiva è quasi sempre necessario come infezioni biofilm-based sono raramente cancellati da soli, anche in individui immunocompetenti. Staphylococcus aureus è uno dei patogeni più frequentemente osservati implicati nella complicazioni biofilm correlati che si verificano durante l'uso di dispositivi medici invasivi ^3.

Purtroppo, la natura stessa del biofilm da barriera protettiva rende più resistenti al trattamento delle cellule planctoniche ^1,4, e la valutazione della efficacia clinica predetto è una parte critica sia inizialelo sviluppo di farmaci così come la sorveglianza della resistenza ai farmaci. Vi è un crescente riconoscimento che condizioni di laboratorio, si è concentrata sulle culture planctonici, potrebbero non rappresentare fedelmente la malattia del mondo reale ^5. Ulteriori aggravando il problema, la replica di fenotipi biofilm è difficile, e modelli biofilm esistenti sono noioso e soffrono di alta inter- e intra-assay variabilità ^6. Così, molti ricercatori, per necessità, di default per saggi cellulari planctonici di sensibilità ai farmaci, quindi potenzialmente trascurare un aspetto importante della virulenza batterica e la malattia.

Qui si descrive il protocollo per il saggio di batteri, in particolare S. aureus, in biofilm pre-grown utilizzando una base di ^7,8 sistema di biofilm ben 96. Mentre il protocollo per la formazione di biofilm e la sfida segue essenzialmente la raccomandazione del costruttore, presentiamo una metodologia ricca di informazioni alternative per quantificare la fattibilità del BIOFilm dopo sfida. Brevemente, i batteri sono coltivate in piastra piolo, dove biofilm formano sui pioli sporgenti collegati al coperchio della piastra. Dopo la formazione di biofilm, i pioli sono delicatamente immersi in pozzetti di una piastra fresca ripiena con PBS per rimuovere le cellule planctoniche. Il peg-coperchio, con biofilm allegate, viene trasferito in una nuova piastra sfida, contenente varie concentrazioni di antibiotici da dosare. Dopo una seconda incubazione, coperchi sono nuovamente rimosso, lavato, e trasferiti ad una piastra di recupero contenente resazurina tintura, dove subiscono una incubazione finale. conversione resazurina può essere registrata cineticamente o preso come una lettura finale dopo un periodo di recupero definito. Questo metodo di tintura a base di quantificare la vitalità del biofilm si differenzia notevolmente dalle noiose CFU (unità formanti colonie) metodologia basata su conteggio descritto nel protocollo originale ^7. OD ₆₀₀ misurazioni della piastra sfida droga e resazurina cinetiche di conversione fungono redditività letturaout di cellule planctonici e biofilm, rispettivamente, offrendo un test veloce, affidabile e tecnicamente semplice ricco di informazioni per la sopravvivenza biofilm.

Protocol

1. biofilm Initiation Crescere una cultura di biofilm producono organismo in un mezzo ricco di nutrienti. Seminare Staphylococcus aureus ceppo Newman in 10 ml di terreno Mueller-Hinton da uno stock di glicerolo. Eseguire tutti i lavori che coinvolgono la gestione di S. aureus con i guanti e all'interno di un armadio biosicurezza. Incubare per 16 ore a 37 ° C su shaker rotativo (100-200 rpm). Determinare OD 600 della coltura utilizzando uno spettrofotometro…

Representative Results

Il saggio resazurina è abbastanza sensibile per rilevare in modo affidabile pochissime cellule vitali in grado di replicare in terreno privo di droga dopo la sfida. In questa metodologia, definiamo la concentrazione di biofilm sradicare minima come la concentrazione più bassa alla quale nessuna conversione resazurina è visto entro 24 ore. Il test si basa su resazurina molecole ossidanti presenti nelle cellule metabolicamente attivi che convertono il colore della tintura dal blu al ros…

Discussion

Qui, abbiamo descritto un saggio biofilm modificato per determinare l'attività di inibitori testati su S. biofilm aureus concentrandosi sullo stato metabolico delle cellule biofilm associato. Mentre il biofilm iniziazione descritto e procedure di contestazione per lo più imitate raccomandazioni del produttore, l'uso di resazurina colorante per rilevare e quantificare le cellule biofilm associato che sopravvivono una sfida inibitore 24 ore semplifica notevolmente la procedura raccomandata di r…

Materials

Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G