Segmentação de biofilme Associated<em> Staphylococcus aureus</em> Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Summary

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Abstract

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Introduction

Micróbios patogênicos podem formar biofilmes in vivo que levam a infecções crónicas não agudos ^1. Infecções associadas aos biofilmes é um fator de risco grave de procedimentos médicos que envolvem a implantação de objetos estranhos (por exemplo, substitutos ósseos artificiais, implantes de mama) ou a instalação de tubos traqueais ou cateteres urinários ^2. Nestes contextos, a terapia anti-infecciosa é quase sempre necessário, como infecções baseados em biofilme raramente são apuradas por conta própria, mesmo em indivíduos imunocompetentes. Staphylococcus aureus é um dos patógenos mais frequentemente observadas implicados em complicações relacionadas com o biofilme que ocorrem durante o uso de dispositivos médicos invasivos ^3.

Infelizmente, a própria natureza do biofilme como uma barreira de protecção torna-as mais resistentes ao tratamento do que as células planctônicas ^{de 1,4,} e a avaliação da eficácia clínica predito é uma parte crítica de ambos inicialdesenvolvimento de medicamentos, bem como a vigilância da resistência de droga. Há um crescente reconhecimento de que condições de laboratório, com foco em culturas planctônicas, podem não representar fielmente a doença no mundo real ^5. Para agravar ainda mais o problema, a replicação de fenótipos de biofilme é difícil, e os modelos de biofilmes existentes são tediosos e sofrem de elevada variabilidade inter- e intra-ensaio de ^seis. Assim, muitos pesquisadores, por necessidade, o padrão para ensaios de células planctônicas de sensibilidade às drogas, assim potencialmente negligenciar um aspecto importante da virulência bacteriana e doenças.

Aqui descrevemos o protocolo para o ensaio de bactérias, especificamente S. aureus, em biofilmes pré-cultivadas utilizando uma base ^7,8 sistema biofilme de 96 poços. Enquanto o protocolo para a formação de biofilme e desafio segue essencialmente a recomendação do fabricante, apresentamos uma metodologia alternativa rico em informações para quantificar a viabilidade do BIOFilm após o desafio. Em resumo, as bactérias são cultivadas na placa de PEG, onde formam biofilmes sobre as cavilhas salientes ligados a tampa da placa. Após a formação do biofilme, os pinos são suavemente mergulhado em poços de uma placa fresca cheio com PBS para remover as células planctônicas. O PEG-tampa, com biofilmes em anexo, é transferido para uma nova placa de desafio, contendo várias concentrações de antibiótico a ser ensaiado. Após uma segunda incubação, as tampas são novamente removidos, lavados e transferidos para uma placa de recuperação de corante contendo resazurina, onde são submetidos a uma incubação final. conversão resazurina pode ser gravado cineticamente ou tomado como uma leitura nó de extremidade após um período de recuperação definido. Este método à base de corantes de quantificação da viabilidade do biofilme difere consideravelmente de CFU (unidades formadoras de colónias) tediosas metodologia baseada em contar descrito no protocolo original ^7. OD ₆₀₀ medições da placa desafio de drogas e resazurina cinética de conversão servir como leitura viabilidadeouts de células planctônicas e biofilme, respectivamente, oferecendo um ensaio rápido, confiável e tecnicamente simples rico em informações para a sobrevivência do biofilme.

Protocol

1. biofilme Iniciação Crescer uma cultura de biofilme organismo produtor num meio rico em nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus estirpe Newman, em 10 ml de meio de Mueller-Hinton a partir de um stock de glicerol. Realizar todos os trabalhos envolvendo a manipulação de S. aureus com luvas e dentro de um gabinete de biossegurança. Incubar durante 16 horas a 37 ° C num agitador rotativo (100-200 rpm). Determinar DO600 da cultura utilizando um espectrofo…

Representative Results

O ensaio resazurina é sensível o suficiente para detectar com segurança muito poucas células viáveis, capazes de se replicar em meio livre de drogas após o desafio. Nesta metodologia, define-se a concentração mínima de biofilme erradicação como a concentração mais baixa à qual nenhuma conversão resazurina é observada após 24 h. O ensaio baseia-se resazurina em moléculas oxidativos encontrados em células metabolicamente activas, que convertem a cor do corante de azul pa…

Discussion

Aqui, nós descrevemos um ensaio de biofilme modificado para determinar a actividade de inibidores testados em S. biofilmes aureus com foco no estado metabólico das células do biofilme associado. Enquanto a iniciação biofilme descritos e procedimentos de desafio recomendações do fabricante principalmente imitava, a utilização de resazurina corante para detectar e quantificar células associada-biofilme que sobrevivem a um desafio inibidor 24 h simplifica significativamente o procedimento recome…

Materials

Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G